组织工程化骨的构建与玻璃化冻存的体外实验研究

摘要

目的: 组织工程化骨(TEB)是目前骨缺损修复理想的骨移植材料之一，但常规的体外构建过程需要一段时间，无法满足临床上即刻骨缺损修复的要求。本研究针对这一问题进行了两种解决方案的体外实验研究。 1. 有实验报道用骨髓单个核细胞(BMNCs)复合材料即刻构建的组织工程化骨进行体内骨缺损的即刻修复有一定的效果。但无体外实验对此方案的成骨效果进行论证，为此本实验通过在成骨诱导环境的体外检测来对此方案进一步加以验证。 2. 常规构建的组织工程化骨若能获得理想的深低温保存效果则可作为实现即刻骨缺损修复的另一方案。玻璃化冻存是目前最有发展前景的冻存方法，因此本实验进行体外检测来验证玻璃化冻存TEB的可行性。 方法: 1. 用1.063g/mLPercoll液分离Beagle犬骨髓单个核细胞(cBMNCS)。将猪股骨头制备成直径5毫米(mm)、厚度1mm的部分脱钙骨(pDBM)支架材料。通过cBMNCs在pDBM上粘附率的检测，获得理想的细胞接种密度。用此密度的cBMNCs分别经过诱导培养或常规培养的第二(P2)代成骨诱导或未诱导犬骨髓基质干细胞(cBMSCs)复合pDBM常规构建的TEB与该密度cBMNCs复合pDBM即刻构建的TEB共同进行成骨诱导培养，体外分析比较各自的细胞活性和成骨能力。 2. 通过用不同组成和浓度的玻璃化液在不同的预处理条件下对P2代成骨诱导cBMSCs复合pDBM常规构建的TEB进行玻璃化冻存，选出适宜的玻璃化液和预处理条件。以VS55作对照，用新研制的玻璃化液分别玻璃化冻存TEB7天或3个月，观察TEB经玻璃化冻存后的细胞活性和成骨能力。 结果: 1. 采用Percoll密度梯度离心法可获得纯度较高的cBMNCs。在pDBM上接种cBMNCs适宜的密度是30×106/mL。通过P2代成骨诱导和未诱导cBMSCs复合pDBM常规构建TEB与cBMNCs复合pDBM即刻构建TEB的体外成骨培养检测中发现尽管即刻构建的TEB在相同的检测时间内细胞活性和成骨能力较低，但随着培养时间的延长可具有很大的提升空间。 2. 用玻璃化液VS442在0℃/15分钟的预处理条件下玻璃化冻存由P2代成骨诱导cBMSCs复合pDBM常规构建的TEB可获得较好的冻存效果。在与VS55的比较中，用VS442进行TEB玻璃化冻存后的细胞活性和成骨能力明显强于VS55，将玻璃化冻存时间从7天延长至3个月时并未对细胞活性和成骨能力造成影响。 结论: 11.063g/mLPercoll液能够较好的分离获取Beagle犬BMNCs。30×106/mL是cBMNCs复合pDBM即刻构建TEB适宜的细胞接种密度。通过在成骨诱导环境的体外检测证实了即刻构建的TEB是可以直接回植来满足体内即刻骨缺损修复的要求。 2VS442是玻璃化冻存常规构建TEB适宜的玻璃化液。在同VS55比较中可见VS442对保持TEB玻璃化冻存后的细胞活性和成骨能力方面效果显著，因此用VS442玻璃化冻存的TEB是可以满足临床上骨缺损的即刻修复需求。

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引言

第一章 犬骨髓单个核细胞的分离和体外成骨诱导培养

第二章 犬骨髓基质干细胞复合部分脱钙骨的体外生长和成骨活性

第三章 犬骨髓单个核细胞复合部分脱钙骨的体外检测

第四章 犬骨髓基质干细胞的深低温保存

第五章 组织工程化骨的深低温保存

第六章 组织工程化骨的玻璃化冻存

全文结论

综述：大鼠颅骨缺损模型在骨组织工程中的应用

参考文献

附录(1)

附录(2)

致谢

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