重组人Hexastatin蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达及蛋白纯化

摘要

血管发生是从已有的血管中形成新生的管道，它对于生物体内很多正常的生理过程来说是至关重要的。1971年Folkman提出了著名的“肿瘤饥饿疗法”，即肿瘤的生长和转移离不开新生血管的形成，氧气从血管中扩散的最大限值是150μm，通过抑制肿瘤新生血管的形成，阻断肿瘤细胞赖以生存的氧气及营养供给，肿瘤细胞便会发生凋亡。此学说的提出为肿瘤的生物治疗提供了新的策略，寻找内源性的血管生成抑制因子成为近年来研究的热点。
　　 Hexastatin来源于细胞外基质，是Ⅳ型胶原蛋白α6链的非胶原区NC1，由229个氨基酸组成，分子量是25 kD。近年来研究表明Hexastatin可以通过一种RGD非依赖方式与整合素分子αvβ3结合，调节内皮细胞的黏附和迁移，并且剂量依赖性地抑制内皮细胞的增殖，对新生血管的生成起到显著的抑制作用。另外，实体瘤实验证实Hexastatin还能有力地抑制肿瘤细胞的生长，它在癌组织中含量的下调可以作为肿瘤浸润的重要指标，起到提前预警的作用。
　　 本研究从人食管癌EC9706细胞中克隆出Hexastatin基因，在大肠杆菌中进行了可溶性表达，并利用麦芽糖结合蛋白（Maltose Binding Protein，MBP）可专一性结合于直链淀粉（Amylose）亲和树脂的特性，对表达产物作了进一步的纯化。实验结果：经PCR扩增成功获得了687 bp的人Hexastatin基因，测序正确，重组人Hexastatin基因在BL21菌体中获得了高效可溶性表达，表达的可溶性蛋白占总蛋白量的24.8％，纯化后的MBP-Hexastatin融合蛋白纯度可达90％，Western blot证实表达蛋白为目的蛋白。人Hexastatin基因克隆、表达及纯化的成功，为进一步在体内外研究其生物活性奠定了基础，同时也为肿瘤的生物治疗提供了新的方法和途径。

目录

文摘

英文文摘

技术路线及流程示意图

前 言

材料与方法

1 实验材料

1.1 主要实验仪器

1.2 主要实验试剂

1.3 引物

1.4 菌株、细胞株及质粒

1.5 主要溶液

2 实验方法

2.1 人Hexastatin基因的克隆和克隆载体的构建

2.2 表达载体pMAL-c4x-Hexastatin的构建

2.3 重组人Hexastatin蛋白的表达及纯化

实验结果

讨 论

结 论

参考文献

附录一：综述一 新型肿瘤血管生成抑制剂Hexastatin的研究进展

参考文献

附录二：综述二 源于Ⅳ型胶原的肿瘤血管生成抑制剂

参考文献

附录三：英文缩略词汇表

致谢

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