胆固醇基-羧甲基可德兰衍生物自聚集纳米粒子的制备以及作为抗肿瘤药物载体的研究

摘要

本研究利用内源性小分子胆固醇疏水性修饰可德兰衍生物--羧甲基可德兰合成新型两亲性高分子聚合物并用以制备自聚集纳米粒子，用抗肿瘤药物表阿霉素为模型药考察载体对小分子药物的包埋及释放行为；利用体外细胞培养技术考察载药纳米粒子的抗瘤效应及细胞毒性，利用动物实验考察载药纳米粒子在动物体内的药代动力学和不同组织的分布情况。主要研究内容及结果如下：
　　 采用化学的方法合成了一系列不同取代度的胆固醇基羧甲基可德兰（CCMC），并用电位滴定、红外光谱（FT-IR）、氢核磁光谱（1H NMR）、X射线衍射（XRD）、差示扫描量热仪（DSC）、高效液相仪（HPLC）对原料、中间产物以及产物的化学结构及物理特征进行了表征；用硫酸铁氨比色法计算出系列CCMC的胆固醇取代度，取代度分别为2.3，3.5和6.4（％，每一百个羧甲基可德兰糖单元）。采用透析加探头超声法在水中制备了CCMC自聚集纳米粒子；并用透射电镜（TEM）、动态光散射仪（DLLS）、Zeta-电位仪和荧光光谱对CCMC自聚集纳米粒的形态、大小以及在水溶液中的性质进行了表征，结果表明，CCMC在水相中能形成规则球形的纳米粒子，粒径（144～233 nm）随着胆固醇取代度的增加而减小；CCMC自聚集纳米粒子的Zeta-电位在蒸馏水中为负值，说明带负电荷的羧甲基位于纳米粒子的表面；CCMC材料的临界聚集浓度（2.6×10-2～9.2×10-2mg/mL）与胆固醇的取代度有关，当胆固醇取代度增大时其临界聚集浓度减小。
　　 以抗肿瘤药物表阿霉素为模型药物，采用硫酸铵梯度法制备了负载表阿霉素的CCMC自聚集纳米粒子，结果表明，载药量随着药物和载体材料比的增加而增加，包封率为78.0％～65.6％。透射电镜（TEM）观察显示，载药纳米粒子为均匀的球形，表面较空白纳米粒子粗糙；这可能是由于有一部分药物吸附在纳米粒子表面。动态光散射（DLLS）结果表明载药纳米粒子的粒径为294.4～510.4 nm，且随着载药量的增加而增加，表阿霉素在CCMC自聚集纳米粒子中的释放速率与释放介质的pH值和载药量相关，释放速率随释放介质pH值的升高而减慢，随载药量的增加而减慢。
　　 CCMC自聚集空白纳米粒子、载药CCMC纳米粒子对HeLa细胞的体外细胞实验表明，当空白纳米粒子浓度高达100μg/mL时对HeLa细胞的生长无抑制作用。当载药纳米粒子或游离药物中药物浓度在0.01～10μg/mL范围内时有抑瘤作用；当药物浓度<1μg/mL时载药纳米粒子对HeLa细胞的抑制作用比游离药物稍强；当药物浓度在1～10μg/mL时载药纳米粒子对HeLa细胞的抑制作用比游离药要明显增强；同时，随着药物与细胞孵育时间的增加其对细胞的抑制作用也随之增加。流式细胞仪及激光共聚焦显微镜研究结果表明，游离药物主要分布于细胞核而载药纳米粒子分布在细胞核及细胞浆，同时HeLa细胞对载药纳米粒子的摄取明显要高于对游离药物的摄取。
　　 载药CCMC纳米粒子、游离药物的Wister大鼠体内药代动力学实验和组织分布实验结果表明，载药CCMC纳米粒子在大鼠体内可达到长循环和缓慢释放的作用，既能减少药物的毒副作用，也能更好地延长药物作用时间；载药CCMC纳米粒子能显著改变药物在大鼠各脏器的分布情况，大大降低药物对心脏的毒副作用，同时也避免了。肾小球的过滤作用。载药CCMC自聚集纳米粒子、游离药物的抗肿瘤药效学研究结果表明，载药CCMC纳米粒子能降低药物的毒性，给药第14天，载药CCMC自聚集纳米粒子与游离药物均表现出显著的肿瘤抑制作用，尤其是载药CCMC纳米粒子组对肿瘤的抑制作用随着时间的延长而增强，在给药14天，肿瘤抑制作用显著强于游离药物组。这可能是由于载药CCMC纳米粒子在体内具有长循环作用，这种长循环的作用赋予了载药CCMC纳米粒子在被动靶向过程中具有EPR效应，增加药物在肿瘤部位的蓄积，从而提高抗肿瘤效率。
　　 总之，胆固醇基羧甲基可德兰衍生物可以通过自聚集的方法制备成纳米粒子，制备方法简单可行。CCMC自聚集纳米粒子可以作为抗肿瘤药物载体包载双亲性或疏水性药物，延缓药物的释放从而降低药物的毒副作用，可望将其作为一种新型的抗肿瘤药物载体用于抗肿瘤药物制剂的开发。

目录

文摘

英文文摘

第一章 绪论

1.1 聚合物纳米粒子作为药物载体的研究进展

1.1.1 纳米药物载体的特点

1.1.2 纳米药物载体的分类及优点

1.2 两亲性聚合物胶束作为药物载体的研究进展

1.2.1 两亲性嵌段共聚物自组装纳米粒子

1.2.2 两亲性接枝共聚物自组装纳米粒子

1.2.3 两亲性聚电解质复合形成的纳米粒子

1.2.4 树枝状聚合物形成的纳米粒子

1.3 改性多糖自聚集纳米粒子作为药物载体的研究进展

1.3.1 壳聚糖（Chitosan）及其衍生物自聚集纳米粒子作为药物载体研究

1.3.2 普鲁兰多糖（Pullulan）及其衍生物自聚集纳米粒子作为药物载体研究

1.3.3 葡聚糖（Dextran）及其衍生物自聚集纳米粒子作为药物载体研究

1.3.4 肝素（Heparin）及其衍生物自聚集纳米粒子作为药物载体研究G

1.3.5 藻酸盐（Alginate）及其衍生物自聚集纳米粒子作为药物载体研究

1.3.6 环糊精（Cyclodextrin）及其衍生物自聚集纳米粒子作为药物载体研究

1.3.7 可德兰（Curdlan）多糖及其衍生物自聚集纳米粒子作为药物载体研究

1.4 课题的提出

1.4.1 新型两亲性共聚物胆固醇基-羧甲基可德兰多糖的合成及结构表征

1.4.2 胆固醇基-羧甲基可德兰溶液性质考察、自聚集纳米粒子的制备和表征

1.4.3 胆固醇基-羧甲基可德兰多糖自聚集纳米粒子作为小分子药物载体的研究

1.4.4 载药CCMC纳米粒子的体外抗瘤实验

1.4.5 载药CCMC纳米粒子及游离药物在动物体内药代动力学评价、体内组织分布及抗肿瘤药效学

参考文献

第二章 胆固醇基-羧甲基可德兰衍生物的合成及结构表征

2.1 前 言

2.2 实验部分

2.2.1 试剂与仪器

2.2.2 羧甲基可德兰的制备

2.2.3 羧甲基取代度的检测

2.2.4 胆固醇基-羧甲基可德兰衍生物（CCMC）的制备

2.2.5 胆固醇取代度的测定

2.2.6 CMC和CCMC的FT-IR、1H-NMR、DSC和XRD表征

2.3 实验结果与讨论

2.3.1 羧甲基可德兰的制备

2.3.2 羧甲基可德兰的结构表征

2.3.3 羧甲基取代度的检测

2.3.4 胆固醇基-羧甲基可德兰衍生物的制备

2.3.5 胆固醇基-羧甲基可德兰衍生物的结构表征

2.3.6 可德兰及其衍生物的物理特征

2.3.7 CCMC中胆固醇取代度的检测

2.4 小结

参考文献

第三章 胆固醇基-羧甲基可德兰衍生物自聚集纳米粒子的制备及物化性质

3.1 前 言

3.2 实验部分

3.2.1 试剂与仪器

3.2.2 CCMC的自聚集行为及临界胶束浓度测定

3.2.3 CCMC自聚集纳米粒子的制备

3.2.4 CCMC自聚集纳米粒子的形态观察

3.2.5 CCMC自聚集纳米粒子的粒径、粒径分布及Zeta电位检测

3.2.6 冻干过程对自聚集纳米粒子形态的影响

3.3 结果与讨论

3.3.1 CCMC的自聚集行为及临界胶束浓度测定

3.3.2 CCMC的自聚集纳米粒子的制备及形态观察

3.3.3 CCMC的自聚集纳米粒子形成机制探讨

3.4 小结

参考文献

第四章 胆固醇基-羧甲基可德兰衍生物自聚集纳米粒子载药及体外细胞实验

4.1 前 言

4.2 实验部分

4.2.1 试剂与仪器

4.2.2 载药CCMC3.5自聚集纳米粒子的制备

4.2.3 载药CCMC3.5自聚集纳米粒子的形态观察及粒径分析

4.2.4 载药CCMC3.5自聚集纳米粒子中表阿霉素含量分析方法的建立

4.2.5 载药CCMC3.5自聚集纳米粒子的载药量及包封率的测定

4.2.6 载药CCMC3.5自聚集纳米粒子的体外释放

4.2.7 细胞培养液的配制

4.2.8 HeLa细胞的复苏及培养

4.2.9 细胞毒性实验

4.2.10 细胞摄取实验

4.2.11 统计方法

4.3 结果与讨论

4.3.1 载药CCMC3.5自聚集纳米粒子的制备及表征

4.3.2 载药CCMC3.5自聚集纳米粒子中表阿霉素含量分析方法的建立

4.3.3 载药CCMC3.5自聚集纳米粒子载药量及包封率的测定

4.3.4 载药CCMC3.5自聚集纳米粒子的体外释放

4.3.5 HeLa细胞培养

4.3.6 细胞毒性实验

4.3.7 细胞摄取实验

4.4 小结

参考文献

第五章 载药胆固醇基-羧甲基可德兰自聚集纳米粒子的药动学、组织分布与抗肿瘤药效学研究

5.1 前 言

5.2 实验部分

5.2.1 试剂与仪器

5.2.2 大鼠血浆中表阿霉素含量测定方法的建立

5.2.3 方法学考察

5.2.4 载药纳米粒子在大鼠体内的药动学研究

5.2.5 大鼠组织中表阿霉素含量测定方法的建立[7，8]

5.2.6 大鼠组织中表阿霉素含量的测定

5.2.7 载药CCMC3.5自聚集纳米粒子的抗肿瘤药效学研究

5.2.8 统计学分析

5.3 结果与讨论

5.3.1 大鼠血浆中表阿霉素含量测定方法的建立

5.3.2 方法学考察

5.3.3 载药纳米粒子在大鼠体内的药动学研究

5.3.4 大鼠组织中表阿霉素含量测定方法的建立

5.3.5 大鼠组织中表阿霉素含量的测定

5.3.6 载药CCMC3.5自聚集纳米粒子的抗肿瘤药效学研究

5.4 小结

参考文献

全文总结

致谢

发表论文情况