胚胎干细胞在成体骨髓中长期存活的观察研究

摘要

目的：胚胎干细胞（embryonicstemcells，ESCs）成为当今生命科学和生物技术研究的热点，这是因为它具有自我更新和多能分化的能力。多年来，“成体组织中是否存在胚胎干细胞”一直是一个很有争议的问题，很多实验室已报道可以从骨髓中分离出来ESCs样的多能干细胞，这些细胞都表达ESCs特异性标志Oct4基因，能像ESCs一样无限分裂繁殖，而且可以分化成几乎所有类型的细胞。但是对于这些原始细胞的来源和存在机制，人们并不清楚。因此，骨髓中是否存在ESCs就变成了一个很有争议的问题。
　　 之前的研究都是通过不同的方法从骨髓中分离、提取并培养这些ESCs样的干细胞，而我们首次通过相反的方式直接将小鼠ESCs注入到小鼠的骨髓腔里，通过观察ESCs在体内的分布生长情况，从而思考体内是否有这样一个适宜ESCs生存的环境。
　　 方法：为了更好地追踪ESCs在体内的生长情况，我们新建两株带绿色荧光标记（greenfluorescentprotein，GFP）的ESCs--oGFP+ESCs（C57BL/6×Oct4/EGFP转基因OG2小鼠）；和aGFP+ESCs（129/Sv×CAG/EGFP转基因C57BL/6-Tg小鼠）。oGFP+ESCs中GFP的表达受Oct4启动子调控，Oct4表达时GFP才表达；aGFP+ESCs中GFP的表达受chicken-beta-actin启动子调控，无论细胞分化与否，GFP均表达。为了避免了ESCs在体内其它器官的阻滞和损失，我们直接将ESCs通过胫骨注射植入到同源的C57BL/6小鼠（分照射组和非照射组）骨髓腔内。
　　 移植后，通过双光子荧光显微镜来观察GFP+细胞在小鼠骨髓腔里存活的时间和状态。另在不同的时间点，我们从移植小鼠的骨髓腔里再次分离出这些GFP+的细胞，采用建立ES细胞系的方法使这些Oct4+-GFP+细胞建成稳定细胞系，并检测这些新建细胞系的功能。通过基因芯片检测来比较这些细胞系和母代ESCs在基因表达水平上的差异。另一方面，我们通过流式细胞学检测和体外培养的方式，分析移植的ESCs在骨髓这种造血微环境下的分化特征。
　　 结果：通过双光子荧光显微镜观察发现100天后，骨髓中仍然存在Oct4-GFP表达的类似ESCs的细胞。大多数GFP+细胞位于移植侧胫骨的注射部位，也有少部分GFP+细胞位于注射骨对侧的骨髓腔内。在不同的时间点，我们从移植小鼠的骨髓腔里分离出这些Oct4+-GFP+的细胞，建成稳定细胞系。到目前为止，我们成功建立了8株细胞系，形态同ESCs。通过对这些Oct4+细胞系的功能性检测发现它们具有与ESCs相似的特性，但这种细胞系生成嵌合鼠的嵌合率很低，且不能生殖系传递。芯片结果显示这些细胞与母代ESCs比较，部分基因表达水平发生了改变，表观遗传学也发生了逐渐的变化。
　　 另外，移植的ESCs在骨髓腔内大多数分化成了非造血的细胞，形态多样，与骨质连接紧密，而仅有少部分分化成了造血细胞，并可进入血循环。
　　 结论：1）我们的研究首次通过直接将ESCs移植入小鼠骨髓腔来证实了成体环境中长期存在ESCs的可能性，对以后干细胞的应用，在成体内的发育和分化研究具有一定的提示作用：
　　 2）由于原始的胚胎干细胞在体内可以长期存在，因此在使用ESCs或ESCs衍生物做细胞治疗或移植过程中，安全性一定要长期关注；
　　 3）胚胎干细胞在成体骨髓中存活一段时间后，逐渐发生了表观遗传学方面的变化，这种变化影响了ESCs的多能性改变，因此在以后细胞移植过程中，我们需要关注这些细胞表观遗传学方面的影响；
　　 4）ESCs在骨髓腔内存活一段时间后，大多数分化成了非造血细胞。我们的研究首次说明了ESCs在骨髓微环境的分化趋势，对ESCs的分化潜能和周围环境的关系以及ESCs的应用具有一定的提示作用。

目录

文摘

英文文摘

前言

第一部分 小鼠胚胎干细胞的建系及鉴定

试剂与材料

实验方法

第一部分 结果

第一部分 讨论

第二部分 骨髓腔内移植模型的建立和观察

试剂与材料

实验方法

第二部分 结果

第二部分 讨论

第三部分 移植后骨髓来源的Oct4+细胞系的建立及检测

试剂与材料

实验方法

第三部分 结果

第三部分 讨论

第四部分 胚胎干细胞的在成体骨髓内的分化

试剂与材料

实验方法

第四部分 结果

第四部分 讨论

参考文献

全文总结

综述 成体骨髓中多能干细胞的种类及其应用

参考文献

附页

博士期间发表文章

申请专利

博士学位论文的资助项目

会议摘要

英文缩略词

致 谢