猪瘟间接ELISA和猪瘟及主要繁殖障碍病的荧光PCR技术的研究

摘要

对猪瘟抗体水平检测是制定合理的免疫程序，监测疫苗免疫效果的基础。本研究利用猪瘟病毒(CSFV)免疫优势蛋白E2蛋白具有4个独立的抗原结构域的特点，将E2的免疫活性区域进行原核表达。采用PCR技术，从已构建好的含有E2全长基因的S21质粒中分别扩增出E2蛋白的4个抗原决定域，并克隆入ptMAL-p2X载体中，构建了4个原核表达载体E2-abcd／pMAL-p2X、E2-ala2／pMAL-p2X、E2-b／pMAL-p2X和E2-c／pMAL-p2X。通过对四种表达菌的筛选，最后选择BL21-CodonPlus(DE3)-RP作为受体表达菌。电泳结果显示均获得可溶性表达，目的蛋白的表达量占总蛋白的15％-30％。将重组的目的蛋白进行亲和层析纯化，作为包被抗原，初步建立了检测猪瘟抗体的间接ELISA方法。实验证明，该方法对标准的CSF阳性及阴性血清的具有良好的敏感性。 猪瘟感染确诊的主要依据是对CSFV的实验室检测。因此，本研究设计了多种探针和引物，初步建立了双重实时荧光PCR技术，检测包括CSFV在内的4种可引起繁殖障碍的病毒，即猪瘟病毒(CSFV)，猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)，猪伪狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)。实验证明，所设计的探针和引物具有良好的特异性。实时荧光PCR检测各种病原的敏感性试验结果显示，检测CSFVcDNA的敏感性达2-3，而nest-PeR的敏感性可达2-9；检测PRRSVcDNA的敏感性达2-2，而nest-PCR的敏感性可达2-5；实时荧光PCR检测PRV的敏感性可达10，而常规PCR方法可达10-4；检测PPV的敏感性达10-6，而常规PCR方法可达10-4。

目录

缩略语一览表

研究背景与文献综述

第一章猪瘟病毒E2基因4个抗原结构域的原核表达及间接ELISA方法的初步研究

第二章猪瘟及猪繁殖障碍性疾病病原的双重实时荧光PCR检测方法研究

结论

对本研究下一步的设想

参考文献

附录：主要仪器设备

致谢

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