CYP2E1对扩张型心肌病及肥厚型心肌病的调节机制研究

摘要

目的：细胞色素氧化酶P4502E1(cytochrome P4502E1,CYP2E1)参与生物体内许多内源性和外源性物的代谢,如乙醇、四氯化碳、丙酮和花生四烯酸等。CYP2E1主要主要分布在肝脏,在脑、肺、胃、肠、心脏等也有高表达。CYP2E1参与脂质过氧化、细胞凋亡等过程,与脂肪性肝病、糖尿病及肿瘤等疾病相关。目前,关于CYP2E1在心脏中的作用以及与心肌病的关系研究未见报道。因此本实验构建了心脏特异的CYP2E1转基因小鼠,用于分析CYP2E1基因在心脏发育过程中的作用以及对cTnTR141W转基因扩张型心肌病(DCM)及cTnTR92Q转基因肥厚型心肌病(HCM)小鼠的调节作用。
　　 方法： cTnTR141W及cTnTR92Q转基因小鼠基因表达芯片及逆转录PCR和western blot检测CYP2E1于扩张型心肌病及肥厚型心肌病模型小鼠中的表达变化。Western blot检测CYP2E1于野生型C57BL/6J小鼠中的时程表达变化。PCR扩增小鼠CYP2E1的cDNA序列,并将其插入α-MHC启动子下游,构建心脏特异转基因表达载体,通过显微注射法建立CYP2E1转基因C57BL/6J小鼠,并分别与cTnTR141W及cTnTR92Q转基因小鼠杂交获得双转基因小鼠。M型超声心动图检测CYP2E1、cTnTR141W、CYP2E1×cTnTR141W、cTnTR92Q及CYP2E1×cTnTR92Q转基因小鼠心脏的结构形态和功能变化,并记录其生存状况。病理组织学染色观察CYP2E1、cTnTR141W、CYP2E1×cTnTR141W、cTnTR92Q及CYP2E1×cTnTR92Q转基因小鼠心脏组织学改变。分光光度法检测CYP2E1、cTnTR141W、CYP2E1×cTnTR141W、cTnTR92Q及CYP2E1×cTnTR92Q转基因小鼠心脏H2O2、丙二醛(MDA)、还原性谷胱甘肽(GSH)及总抗氧化能力(T-AOC)变化。透射电镜观察CYP2E1转基因小鼠心脏超微结构改变。逆转录PCR及和western blot检测CYP2E1转基因小鼠心肌肥厚分子marker表达变化。Western blot检测CYP2E1转基因小鼠心脏信号分子的变化。
　　 结果： cTnTR141W及cTnTR92Q转基因小鼠基因表达芯片及逆转录PCR和western blot结果显示,CYP2E1于肥厚型心肌病模型小鼠心肌中的表达上调,于扩张型心肌病模型小鼠心肌中的表达下调。CYP2E1在野生型C57BL/6J小鼠胚胎期心脏中未见表达,出生后一至二周表达最高,之后随着年龄增长表达下调。建立了心脏组织特异的CYP2E1高表达转基因小鼠,同时建立了心脏组织特异的CYP2E1×cTnTR141W及CYP2E1×cTnTR92Q两种杂交小鼠。M型超声心动图结果表明CYP2E1的过表达:使野生型小鼠发生DCM表型,即心腔扩大,心壁变薄,心功能下降；使cTnTR141W转基因小鼠心脏的DCM表型更加严重:使cTnTR92Q转基因小鼠心脏向心衰发展,即心脏出现失代偿性的心室腔变大,室壁变薄,心功能下降。心脏组织学显示,CYP2E1的过表达加重野生型小鼠、cTnTR141W和cTnTR92Q转基因小鼠的心肌排列紊乱、肥大及间质纤维化程度。至5月龄,CYP2E1转基因小鼠死亡率为8％；cTnTR141W转基因小鼠死亡率为16％；CYP2E1×cTnTR141W转基因小鼠死亡率为48％；cTnTR92Q转基因小鼠死亡率为4％；CYP2E1×cTnTR92Q转基因小鼠死亡率为20％。电镜检测显示CYP2E1转基因小鼠心脏肌纤维粗细不均一,肌浆网扩张,溶酶体增多,线粒体肿胀并伴有脊断裂。RT-PCR及western blot结果表明CYP2E1转基因小鼠心脏心肌细胞肥大分子标志物,包括肌小节蛋白基因Myot、Cnn1,细胞骨架蛋白基因Acta1,细胞外基质基因Colla1、Col3a1,信号传导相关基因Nppa及Nppb均表达增加。分光光度法检查结果表明CYP2E1的过表达可增加野生型小鼠、cTnTR141W和cTnTR92Q转基因小鼠心脏中H2O2和MDA含量,降低GSH和T-AOC。而CYP2E1转基因小鼠心脏中ERK1/2、JNK、P38、P13K、Akt、GSK3B信号分子的总蛋白形式及磷酸化形式未发生改变。
　　 结论：通过对CYP2E1转基因小鼠的研究,我们首次发现CYP2E1可以使小鼠心脏发生DCM表型,且CYP2E1可加重cTnTR141W小鼠的DCM病理表型,使cTnTR92Q小鼠的HCM病理表型向心衰转变。而CYP2E1介导的氧化应激很可能参与到这一病理重塑过程中。