小鼠多囊肾致病基因Biccl在哺乳动物生长发育中的表达和定位

摘要

某些蛋白翻译水平的激活和抑制对胚胎发育过程中的基因表达起到重要的时空调节作用。双尾-C基因Bicaudal-C（Bic-C）最早发现于果蝇(Drosophila)。已有研究表明果蝇Bicaudal-C(dBic-C)的基因产物是一种能与RNA结合的蛋白质分子，并对转录后水平具有重要的调节作用。后来研究者又在多个不同物种（如线虫、爪蟾、小鼠）中发现了dBic-C的同源基因，并且这些同源基因及其蛋白质产物高度保守。小鼠的Bicaudal-C基因(Bicc1)定位于小鼠10号染色体的C1区域。目前已有三种与Bicc1基因相关的小鼠突变体模型—jcpk，bpk，和67Gso被报道。这些小鼠突变体模型均发现Bicc1基因的突变和其肾脏产生严重胞囊化表型，其表型与人类遗传性多囊肾病（Polycystic kidney disease，PKD）极为相似。尽管如此，Bicc1基因的突变与人类遗传性多囊肾病之间的关系以及Bicc1基因突变导致人类遗传性多囊肾病病理表型的具体机制尚不清楚。应用本课题组业已建立的多种遗传性多囊肾病小鼠模型和Bicc1的特异性抗体，我们探究了Bicc1基因产物在哺乳动物生长和发育中的表达分布，并分析了Bicc1与其他遗传性多囊肾致病基因产物（如polycystin-1/-2和fibrocystin）之间的关系。应用我们所研制的抗Bicc1抗体（mBic-Np和mBic-Cp）对不同胚龄(E12.5-E16.5)的野生型小鼠的免疫组化染色结果表明，Bicc1从E12.5天开始表达于脑室脉络丛、鼻腔、背部神经节、心脏、肠道、肾脏、肾上腺等器官;在E13.5天，Bicc1开始在肺部表达;E15.5天于下颌腺、垂体、胰腺等器官表达。在众多表达Bicc1的组织和器官中，腺体类组织中的Bicc1表达量最高。另外，在小鼠胚胎发育的不同阶段中，各阳性组织和器官的Bicc1的表达量没有明显变化。由于Bicc1的突变会导致肾脏囊肿，我们还对不同月龄的野生型小鼠肾脏中Bicc1的表达情况进行了研究。免疫组化染色结果显示在出生后小鼠的肾脏中，Bicc1主要定位于皮髓质交界处，而且其表达量恒定，不随小鼠的月龄而改变。用不同肾单位区段的特异性荧光染料和抗Bicc1抗体共染，我们发现Bicc1多集聚于肾单位的近曲小管。通过将编码Ago-2蛋白的质粒转染到我们所建立的稳定过表达Bicc1的IMCD3细胞株内，我们发现Bicc1与Ago-2共定位于胞浆内的颗粒状结构。由于Ago-2已被报道定位于胞浆内的P小体，所以我们的结果揭示了Bicc1的亚细胞定位。利用本实验室业已建立的Pkd1、Pkd2和Pkhd1基因敲除小鼠，我们对同窝的Pkd1+/+和Pkd1-/-小鼠胚胎、Pkd2+/+和Pkd2-/-小鼠胚胎以及Pkhd1+/+和Pkhd1-/-成体小鼠的肾脏进行免疫组化染色以比较野生型和基因敲除型小鼠Bicc1表达情况的差异。此外，我们还将应用这些基因敲除小鼠中所分离出的肾上皮细胞系，观察敲除Pkd1、Pkd2或Pkhd1后是否影响Bicc1的表达。免疫组化染色、Real-time PCR和Western-blot实验的结果均表明:Pkd2和Pkhd1的敲除均不影响Bicc1的表达，而Pkd1的敲除会导致Bicc1表达的显著下调。这一发现表明ADPKD的致病基因产物PC1与Bicc1的表达具有关联性。综上所述，我们的研究结果初步揭示了Bicc1在小鼠生长和发育过程中的表达和分布以及其亚细胞定位，并发现Bicc1的表达与ADPKD的致病基因Pkd1的表达具有关联性，Pkd1的缺失会导致Bicc1表达水平的下调。由于Pkd1可能对Bicc1的表达产生调控作用，我们认为Bicc1很可能通过Pkd1在人类遗传性多囊肾病发病机制中发挥作用。

目录

中英文缩略词对照

摘要

前言

材料与方法

1．实验材料

1．1 常用仪器设备

1．2 常用试剂

2．实验方法

2．1鼠尾基因组DNA的提取

2．2 RNA的提取

2．3 Real-Time PCR

2．4感受态细菌的制备

2．5 细菌转化

2．6 质粒的提取

2．7 Wbstern-blot

2．8 成体小鼠的灌注和取材

2．9 小鼠胚胎的取材和固定

2．10 石蜡切片法

2．11 HE染色

2．12 免疫组化染色

2．13 细胞免疫荧光染色

2．14 组织免疫荧光染色

2．15细胞转染

2．16 Bicc1过表达细胞株的筛选

2．17 Pkd1过表达细胞株的筛选

2．18 多克隆抗体的纯化

2．18 Real-time PCR的数据的统计和分析

3．常用溶液的配制

3．1 Western-Blot相关试剂

3．2 细胞裂解溶液

3．3 细胞固定相关溶液

3．4 细胞培养相关溶液

3．5 细菌培养相关溶液

3．6 免疫组织化学相关溶液

3．7 基因组提取相关溶液

3．7 抗体纯化所需的溶液

实验结果

一、Bicc1蛋白的表达和定位

1．Bicc1在小鼠胚胎发育过程中的分布和表达

2．Bicc1在成体小鼠肾脏中的分布和表达

3．Bicc1定位于细胞浆内P小体

二、Bicc1与人类遗传性多囊肾病之间的关系

1．Pkhd1的敲除不影响Bicc1的表达

2．Pkd2的敲除不影响Bicc1的表达

3．Pkd1的敲除导致Bicc1的表达下调，过表达Pkd1不影响Bicc1的表达

讨论

参考文献

文献综述 Bicaudal-C基因的分子特征和生物功能

致谢

基金资助

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