应用实时荧光PCR技术进行禽流感灭活疫苗的亚型鉴定

摘要

疫苗免疫是我国控制禽流感的一项重要措施，我国政府对禽流感疫苗的质量非常重视，严把疫苗质量关，加强市场监管，是我所的一项重要职能，建立快速、敏感、特异的疫苗质量检测方法，特别是各亚型的鉴别检测方法，对及时进行产品质量控制和市场监督有着重要意义。为此，我所专门承担国家禽流感科技攻关课题开展此项研究。本实验旨在利用荧光定量PCR方法对H5、H9、H7]E型禽流感灭活疫苗进行亚型快速鉴别检测，为该产品的质量控制和市场监督提供技术支持。 针对H5]I／型禽流感病毒血凝素(HA)基因的保守序列，设计和合成了特异性的引物和TaqmanMGB探针，利用实时荧光定量PCR技术，检测H5亚型禽流感灭活疫苗。对H9、H7]E型禽流感疫苗和其他禽病疫苗无交叉反应，特异性好。组内和组间实验显示重复性良好。同时构建了包含HA基因的标准质粒，进行体外转录并进行梯度稀释，得到一系列已知梯度浓度的RNA标准品，用其绘制标准曲线，表明该方法的灵敏度为10拷贝／反应，标准曲线的相关系数为0．998003，起始拷贝数与ct值之间的线性关系表达式：ct=一3．347424×LogCopynumber+35．885406，通过荧光PCR动力学曲线可以测定出疫苗样品(病毒)的ct值，代入方程，即可以得出疫苗样品(病毒)的HA基因拷贝数。 对50批H5亚型禽流感灭活疫苗进行了荧光定量PCR检测，测定了疫苗的HA基因拷贝数，并对这50批疫苗进行了疫苗的HA基因拷贝数与m抗体效价之间相关性的分析，结果显示不相关。表明HA基因拷贝数测定取代m抗体效价测定来判定禽流感灭活疫苗的免疫效力是不可行的，但是该方法可以定量检测组织，尿囊液等的AIV，通过测定AIV的HA基因拷贝数，即可以知道AIV的具体数目，有其现实意义。 针对H9~I／型禽流感病毒血凝素(m)基因的保守序列，设计和合成了特异性的引物和TaqmanMGB探针，利用实时荧光定量PCR技术，检测H9]E型禽流感灭活疫苗。对H5、H7]I／型禽流感疫苗和其他禽病疫苗无交叉反应，特异性好。重复性佳。 针对HT]I~型禽流感病毒血凝素(HA)基因的保守序列，设计和合成了特异性的引物和TaqmanMGB探针，利用实时荧光定量PCR技术，检测H7亚型禽流感灭活疫苗。对H5、H9~I／型禽流感疫苗和其他禽病疫苗无交叉反应，特异性好。重复性佳。 对鸡胚病毒分离、荧光定量PCR、普通RT-PCR检测AIr的灵敏度作了分析比较，结果显示：鸡胚病毒分离高于荧光定量PCR100--1000倍左右，荧光定量PCR高于普通RT-PCR100---1000倍左右。 所有试验表明荧光定量PCR方法既可进行禽流感灭活疫苗亚型鉴别和快速检测，又可用于禽流感病毒的快速定性定量检测，是一种特异、敏感、快速和简洁的定性、定量检测方法。

目录

摘要

缩略语表

引言

第一章实时荧光PCR技术快速定量检测H5亚型禽流感灭活疫苗

第二章实时荧光PCR技术快速检测H9亚型禽流感灭活疫苗

第三章实时荧光PCR技术快速检测H7亚型禽流感灭活疫苗

第四章实时荧光PCR、常规鸡胚病毒分离以及普通RT-PCR的比较

第五章结论与创新点

参考文献

致谢