以明胶酶为靶点的小型化抗体与力达霉素构建的基因工程强化融合蛋白及其抗肿瘤活性的研究

摘要

抗体-药物偶联物的开发是当前抗肿瘤药物研发的一个重要发展方向，然其成功的发展在某种程度上有赖于抗体部分的靶向运输能力和被输送药物的生物学活性。明胶酶在多种肿瘤中高表达，且在肿瘤的侵袭、转移以及血管生成中发挥着重要的作用，来源于小鼠的单克隆抗体3G11具有特异性结合明胶酶的特性。力达霉素是一个高效的抗肿瘤大分子抗生素，以单克隆抗体3G11为基础，结合力达霉素的特性，我们构建了多种类型的基因工程融合蛋白。为了进一步增强抗体片段对明胶酶高表达肿瘤细胞的靶向能力和提高抗肿瘤效果，我们作了以下的研究和探索。
　　 一、抗明胶酶的双单链抗体和力达霉素的融合蛋白dFv-LDP制备及其体内的靶向能力研究
　　 随着抗体工程的研究进展，目前认为双价的单链抗体片段具有最佳的肿瘤靶向能力。为了进一步提高前期所构建的抗明胶酶单链抗体和力达霉素融合蛋白Fv-LDP-AE的抗肿瘤效果，我们构建了含有2个scFv和力达霉素辅基蛋白的融合蛋白，将其命名为dFv-LDP。表达该重组蛋白的质粒pET30a（+）/dFv-LDP经过酶切鉴定和序列测定后，转化于大肠杆菌BL21（DE3）和Rosetta（DE3）pLysS中，进行诱导表达，结果发现融合蛋白dFv-LDP更易于在Rosetta（DE3）pLysS中表达，产物主要以包涵体的形式存在，目的蛋白经纯化、复性后，每升发酵液可以获得50 mg纯度达到95％以上有活性的dFv-LDP融合蛋白。抗原ELISA结果表明，融合蛋白dFv-LDP与抗原明胶酶的亲和常数为0.043μM，比单链的Fv-LDP融合蛋白的亲和力提高了4倍左右。融合蛋白dFv-LDP亦能与肿瘤细胞特异性结合，对Be1-7402、PG-BE1、HT-1080、HepG2、MCF-7等肿瘤细胞均呈阳性免疫反应。流式细胞术分析表明融合蛋白dFv-LDP在一定程度上能被细胞内吞，相对单链的Fv-LDP来说比率有所增加，但总体不太明显。体内的靶向实验中，融合蛋白dFv-LDP具有比单链的Fv-LDP更优越的肿瘤靶向能力，在人肝癌Be1-7402、高转移肺癌PG-BE1和结肠癌HCT-116裸鼠异位移植瘤中展现了优良的靶向能力，能够很快在肿瘤部位富集。因此，本实验构建的双单链抗体融合蛋白dFv-LDP具有良好的肿瘤靶向能力，有望在同等条件下携带更多的力达霉素分子到达肿瘤部位，从而提高抗肿瘤效果并降低对非靶器官的损伤。
　　 二、融合蛋白dFv-LDP与发色团AE的组装条件的优化
　　 力达霉素是一个大分子抗肿瘤抗生素，可以拆分为一个辅基蛋白和一个高活性的发色团。该发色团可以和基因工程表达的含有力达霉素辅基蛋白结构域的重组融合蛋白组装，构建具有高度活性的强化融合蛋白。然而这种组装效率受一些因素的影响，本文利用融合蛋白dFv-LDP和发色团AE组装作为一个研究对象，拟对这些影响因素进行分析和研究。利用高效液相色谱分析不同摩尔浓度的力达霉素并建立其发色团和辅基蛋白摩尔浓度的标准曲线；在此基础上利用L9（34）正交设计分析组装时的温度、时间、pH以及发色团和基因工程融合蛋白dFv-LDP的摩尔比率4个因素对组装效率的影响，挑选最优组装效率的组合。结果建立了力达霉素发色团和辅基蛋白摩尔浓度的标准曲线，所选择的4个因素对组装效率都有明显的的影响（P<0.01），其影响程度先后顺序是温度>时间>pH>发色团和融合蛋白dFv-LDP浓度的比率；最优的组装条件为温度10℃，时间12h，pH7.0和发色团与蛋白摩尔比率为5:1。经过优化后，融合蛋白dFv-LDP与发色团的组装效率提高了20％左右。该优化组装条件对其他基因工程表达的含有力达霉素辅基蛋白的融合蛋白与发色团组装有一定的参考价值。
　　 三、强化融合蛋白dFv-LDP-AE的体内抗肿瘤作用研究
　　 小动物活体成像表明融合蛋白dFv-LDP具有很好的肿瘤靶向效果，当其与发色团AE组装后，我们进一步评价其体内的抗肿瘤效果。MTT法表明强化融合蛋白dFv-LDP-AE具有不亚于力达霉素的对多种肿瘤细胞强烈的杀伤能力，IC50值介于1×10-10～10-12M之间。小鼠肝癌H22抑瘤实验表明，在等摩尔的情况下，强化融合蛋白dFv-LDP-AE比单价的Fv-LDP-AE有更高的抗肿瘤能力（89.5％ vs84.2％），两者都较单独的力达霉素（73.6％）有明显的提高（P<0.05），说明抗体携带力达霉素的靶向治疗能够提高力达霉素的治疗效果；在肝癌Be1-7402裸鼠移植瘤中，dFv-LDP-AE也展现了更好的抗肿瘤效果，0.4 mg/kg，0.6 mg/kg，0.8 mg/kg三个剂量的dFv-LDP-AE的抑瘤率分别为64.2％、73.1％和87.3％，均强于力达霉素的63.4％抑瘤率。而0.48 mg/kg的Fv-LDP-AE的抑瘤率为73.9％，小于等摩尔浓度下的（0.8 mg/kg）dFv-LDP-AE的抑瘤效果（P<0.05；dFv-LDP-AE（0.8 mg/kg）vs Fv-LDP-AE（0.48 mg/kg））。说明通过增加一个Fv片段，在可耐受剂量下提高了抑瘤效果，降低了对非靶器官的毒副作用。
　　 抗原从肿瘤脱落是抗体-药物偶联物治疗的一个需要考虑的问题，同时也为了进一步提高强化融合蛋白dFv-LDP-AE的抗肿瘤效果，我们尝试了新的给药方案，即大剂量融合蛋白dFv-LDP联合小剂量强化融合蛋白dFv-LDP-AE。在肺癌PG-BE1裸鼠移植瘤中，融合蛋白dFv-LDP在10 mg/kg的抑瘤率为77％，强化融合蛋白dFv-LDP-AE在0.4 mg/kg和0.6 mg/kg时的抑瘤率分别为91.3％和94.2％，较之dFv-LDP融合蛋白有明显的提高（P<0.05）；但两者联合后，抑瘤率进一步增加，两组6个老鼠中都有5个裸鼠的肿瘤体积较治疗前缩小了，缩小的百分率分别为22.0％和49.6％，说明这种联合给药的方案是有效的，免疫组化检测微血管密度CD31和核增值因子Ki-67也证明了这种增效作用。该实验说明融合蛋白dFv-LDP、强化融合蛋白dFv-LDP-AE以及两者的联合可逐步提高抗肿瘤效果。
　　 纤维肉瘤是一种明胶酶高表达的肿瘤，我们以荧光素酶稳定转染的纤维肉瘤HT-1080为研究对象，建立了其实验性肺转移的模型，FITC标记的融合蛋白具有明显靶向实验性肺转移灶的特性。在裸鼠体内试验中，采用融合蛋白dFv-LDP、强化融合蛋白dFv-LDP-AE以及两者联合给药的方式比较了三者在HT-1080的实验性肺转移中的抑制作用。融合蛋白dFv-LDP（10 mg/kg）展现了不错的抗转移的作用，肺部转移灶数目为对照组的55.8％（P<0.01，与对照组相比）；强化融合蛋白dFv-LDP-AE在0.4和0.6 mg/kg的剂量下的转移灶数目分别为对照组的41.4％和25.1％（P<0.05，与dFv-LDP10 mg/kg组相比）；联合dFv-LDP后，其肺部转移灶数目进一步下降，仅为对照组的20.3％（P<0.05，与dFV-LDP-AE0.4 mg/kg组相比）和13.1％（P<0.05，与dFv-LDP-AE0.6 mg/kg组相比），说明通过联合给药的方式，进一步提高了抗转移的效果。融合蛋白dFv-LDP和强化融合蛋白dFv-LDP-AE的联合应用在临床纤维肉瘤的治疗中有潜在的应用前景。
　　 四、抗明胶酶scFv的重链CDR3区与力达霉素构建的基因工程强化融合蛋白及其抗肿瘤作用研究
　　 大剂量未加强化的融合蛋白与小剂量强化的的融合蛋白联合能够进一步提高抗肿瘤的效果，但也可能导致免疫原性的增加。为了降低可能发生的免疫原性，我们做了以下的探索，构建、表达和纯化了仅有scFv重链CDR3区与力达霉素辅基蛋白的CDR3-LDP和CDR3-LDP-CDR3两种融合蛋白。抗原ELISA表明融合蛋白CDR3-LDP和CDR3-LDP-CDR3两者的亲和力差别不大，与明胶酶的亲和常数Kd值分别为5.78 x10-6和6.563 x10-6M。免疫荧光分析表明融合蛋白CDR3-LDP与肿瘤细胞M21、HepG2结合呈阳性。强化后的融合蛋白CDR3-LDP-AE具有强烈的抗肿瘤活性，对Be1-7402和HepG2的IC50分别为1.05x10-11和6.6x10-14mol/L。小鼠肝癌H22动物实验中，融合蛋白CDR3-LDP（10 mg/kg）的抑瘤率为56％；强化融合蛋白CDR3-LDP-AE在0.25和0.5 mg/kg的剂量抑瘤率分别为78.8％和87.1％（P<0.05，与融合蛋白CDR3-LDP相比）；两者联合后，肿瘤抑制率分别提高到85.2％（P<0.05，与CDR3-LDP-AE0.25 mg/kg相比）和92.7％（P<0.05，与CDR3-LDP-AE0.5 mg/kg相比）。
　　 综上所述，双价的融合蛋白dFv-LDP相对于单价的Fv-LDP来说，增强了其体外的亲和力和体内的肿瘤靶向能力；与发色团强化后，强化融合蛋白dFv-LDP-AE也展现了更优越的抗肿瘤效果。体内试验证明大剂量dFv-LDP与小剂量dFv-LDP-AE联合治疗具有强大的抗肿瘤、抗转移作用，具有良好的发展前景。同时该给药方案对其他抗体-药物偶联物的临床应用具有一定的参考意义。

目录

文摘

英文文摘

缩略语表

第一部分 抗明胶酶双单链抗体dFV-LDP的制备及其与抗原明胶酶结合活性的研究

前言

1.实验材料

2.实验方法

3.实验结果

4.讨论

5.参考文献

第二部分 融合蛋白dFV-LDP与力达霉素发色团的组装

前言

1.材料与方法

2.实验结果

3.讨论

4.参考文献

第三部分 强化融合蛋白dFV-LDP-AE在体内外的活性分析

前言

1、材料与方法

2、实验结果

3.讨论

4.参考文献

第四部分 抗明胶酶单链抗体CDR3结构域与力达霉素强化融合蛋白构建及其抗肿瘤作用

前言

1.材料与方法

2.实验结果

3.讨论

4.参考文献

论文结论

文献综述

参考文献

致 谢

附录