结缔组织生长因子在视网膜色素上皮细胞中的作用机制研究

摘要

目的：
　　 本研究欲通过研究结缔组织生长因子(connectivetissuegrowthfactor，CTGF)对人视网膜色素上皮细胞(retinalpigmentepithelialcell，RPE)细胞的刺激作用来探讨增殖性玻璃体视网膜病变(Proliferativevitreoretinopathy，PVR)的发生机制。
　　 方法：
　　 1．培养ARPE-19细胞，使用WesternBlot检测CTGF对ARPE-19细胞外基质成分表达的影响。
　　 2．构建p3xFLAG-CMV14/CTGF真核表达载体，设计及合成三对针对CTGF的siRNA，通过WesternBlot筛选有效靶点，合成有效靶点的OligoDNA，退火形成双链DNA，与线性化的pGC-LV-GFP载体连接，通过PCR筛选阳性克隆并进行DNA测序鉴定；将重组CTGFshRNA的质粒与病毒包装的辅助质粒共转染293T细胞，将包装产生的慢病毒感染ARPE-19细胞，WestemBlot检测CTGF的表达。
　　 3．观察TGF-β2对ARPE-19产生CTGF、FN以及α-SMA的表达的影响作用，以及靶向抑制CTGF后，ARPE-19产生CTGF、FN以及MMP-2以及α-SMA的表达受到干扰的情况
　　 4．细胞刮伤实验测定CTGF对ARPE-19细胞迁移能力的影响以及靶向抑制CTGF后对于ARPE-19细胞迁移能力的影响
　　 结果：
　　 1．CTGF可以明显刺激ARPE-19细胞的增殖。
　　 2．通过双酶切和基因测序证实靶向CTGF的shRNA慢病毒载体构建成功，WesternBlot证实经慢病毒感染后的ARPE-19细胞中的CTGF的蛋白水平明显减低。
　　 3．TGF-β2刺激了ARPE-19产生CTGF、FN以及Q-SMA，而靶向抑制CTGF后，ARPE-19产生CTGF、FN以及MMP-2以及Q-SMA的表达受到干扰。
　　 4．在细胞刮伤实验中，加入了siCTGF的细胞的迁移能力明显下降。
　　 结论：
　　 CTGF可以明显刺激ARPE-19细胞的增殖并随着时间的增加细胞数亦增加，加入siCTGF后可以明显抑制ARPE-19细胞的增殖，细胞数量下降。

目录

声明

第1章 摘要

第2章 缩略词表

第3章 引言

3.1 选题的背景及意义

3.2 本文的研究内容和主要贡献

第4章 CTGF对ARPE-19细胞外基质成分表达的影响

4.1 本章引论

4.2 材料和方法

4.2.1 主要试剂

4.2.2 主要仪器

4.2.3 ARPE-19细胞培养及冻存、复苏

4.3 实验结果

4.3.1 CTGF对ARPE-19细胞外基质成分表达的影响

4.3.2 CTGF对ARPE-19细胞增殖的影响

4.4 讨论

4.4.1 MTT法和CCK-8法检测悬浮细胞增殖的比较

4.4.2 CTGF对ARPE-19细胞的研究展望

参考文献

第5章 靶向干扰CTGF对ARPE-19细胞增殖、迁移及EMT的影响

5.1 本章引论

5.2 材料和方法

5.2.1 主要试剂、缓冲液及溶液配制

5.2.2 主要仪器:见前

5.2.3 GCl92893/SMAD4RNAi慢病毒载体构建

5.2.4 慢病毒包装

5.2.5 ARPE-19细胞的感染

5.2.6 Western Blot检测慢病毒感染后ARPE-19细胞中CTGF的表达

5.2.7 CCK-8法测定靶向干扰CTGF对ARPE-19细胞增殖的影响

5.2.8 细胞刮伤实验(Wound healing)测定靶向干扰CTGF对ARPE-19细胞迁移能力的影响

5.3 结果

5.3.1 p3xFLAG-CMV14/CTGF克隆构建成功

5.3.2 Western Blot检测CTGF RNAi靶点有效性

5.3.3 绿色荧光蛋白检测ARPE-19细胞的感染情况

5.3.4 Western Blot检测ARPE-19细胞对TGF-β2的反应

5.3.1 靶向抑制CTGF后,Western Blot检测ARPE-19细胞对TGF-β2的反应

5.3.2 CCK-8法测定靶向干扰CTGF对ARPE-19细胞增殖的影响

5.3.3 细胞刮伤实验(Wound healing)测定靶向干扰CTGF对ARPE-19细胞迁移能力的影响

5.4 讨论

参考文献

第6章 综述

第7章 结论

7.1 结论

7.2 展望

致谢

个人简历