人HCV亚复制子的斑马鱼肝脏复制模型的研究

摘要

丙型肝炎病毒(HCV)是一种具包膜的单股正链RNA病毒。持续性HCV感染是发展成肝细胞癌(HCC)的主要危险因素。当前在丙型肝炎的预防和治疗中存在着一些问题，如HCV疫苗研究尚未获得突破进展;耐药问题严重，急需新型的抗HCV药物。HCV研究主要障碍是缺乏合适的细胞模型及小动物模型。这极大的限制了HCV致病机制的研究及其药物防治。
　　 HCV core蛋白作为结构蛋白在病毒的致病性方面具有重要作用;HCV非结构蛋白(NS)，则更多在病毒的复制、多蛋白产物的切割、HCV与宿主细胞间相互作用等过程中发挥重要作用，因此研究HCV非结构蛋白的作用机制，利用这些蛋白作为靶点筛选新药具有重要的理论意义和实用价值。
　　 斑马鱼属脊椎动物，其生长发育过程、组织系统结构与人有很高的相似性，两者在基因和蛋白质的结构和功能上也具有很高的保守性，因此斑马鱼是研究人类疾病发生机理的优良模式动物。斑马鱼具有个体小、养殖成本低的优点，是高通量药物筛选的脊椎动物模型。利用突变体或转基因鱼，或野生型斑马鱼均可较方便地进行小分子化合物的筛选，筛选出的化合物可用做进一步的临床测试。因此，本实验尝试利用斑马鱼建立HCV复制模型。
　　 本研究以斑马鱼作为模式动物，运用基因重组和分子生物学方法，获得两种斑马鱼HCV亚复制子模型:斑马鱼顺式HCV亚复制子模型和斑马鱼反式HCV亚复制子模型。
　　 斑马鱼顺式HCV亚复制子模型。利用小鼠肝核因子基因HNF4a启动子调控下游基因表达，顺序连接HCV5｀NTR-core、脑心肌炎病毒内核糖体进入位点IRES、报告基因EGFP和HCV IRES-NS5B-3｀NTR基因序列，构建了HCV亚复制子基因表达构件pHHIGI5B。将此构件显微注射斑马鱼受精卵，经HNF4a启动子转录产生mRNA，由于此构件含有HCV的5｀NTR、core、NS5B和3｀NTR，具备了HCV病毒的亚复制子结构，因此，该mRNA可做为复制模板，在HCV RNA依赖的RNA聚合酶(NS5B)的作用下，产生负链的亚复制子RNA。荧光显微镜下可观察到EGFP荧光在肝脏区域的表达。western-blot可检测到21kD core蛋白带和NS5B蛋白条带。RT-PCR可检测出亚复制子负链RNA的存在，说明注射该基因构件的斑马鱼体内存在HCV亚复制子的复制过程。原位杂交实验也进一步证实斑马鱼幼体肝区存在亚复制子负链RNA。综上，斑马鱼顺式HCV亚复制子模型是成功的。
　　 斑马鱼反式HCV亚复制子模型。该模型通过向斑马鱼受精卵共注射两种HCV基因表达质粒而组成，pIresDsRed-5B可在CMV启动子调控下分别表达HCV RNA聚合酶(NS5B)蛋白和红色荧光蛋白;pRVIresCore-GFP-3N构件可在CMV启动子调控下分别产生反义的HCV5｀NTR-core和IRES-EGFP转录产物(antisense-transcripts)，以及正链HCV3'NTR。当由pIresDsRed-5B转录产生NS5B(HCV RNA-dependant RNA polymerase)时，由pRVIresCore-GFP-3N转录产生的反义RNA就能够作为复制模板，在RNA依赖的RNA聚合酶(NS5B)作用下复制产生互补的mRNA，并被翻译成EGFP和core蛋白。结果显示，在荧光显微镜下可以在同一条斑马鱼幼体肝区观察到绿色荧光和红色荧光，可直观地证明该亚复制子复制过程的存在。 RT-PCR验证了复制产物—正链HCV5｀NTR-core-IRES-EGFP-HCV3'NTR的存在。Western blot结果进一步证实了core和NS5B蛋白(来自复制产生的mRNA)在共注射斑马鱼体内的表达。此外，利用原位杂交技术，EGFP和core的正义和反义RNA探针均在斑马鱼幼体肝区检测到阳性信号;NS5B的反义探针也检测到阳性信号，并且信号主要集中在斑马鱼的肝脏区域。而对照组（只注射了pRVIresCore-GFP-3N基因构件）由于缺少HCV RNA聚合酶，由CMV启动子转录出的反义的RNA不能被“复制”产生互补的mRNA，也未产生HCV Core和GFP蛋白。综上所述，我们成功构建了HCV反式亚复制子斑马鱼模型。
　　 我们利用RT-PCR检测了两种亚复制子注射的斑马鱼幼体中HCV感染容易引起肝脏病变的一些基因markers的表达变化，乙酰辅酶A羧化酶(Ace)、类肝素酶(heparanase)在注射的斑马鱼幼体的表达水平明显升高，表明斑马鱼幼体肝细胞已开始发生脂肪变性。提示HCV亚复制子导入斑马鱼肝脏后，不仅具有复制功能，还可导致肝脏发生类似人体和哺乳类动物模型的HCV病变。这些结果表明，这两种斑马鱼HCV复制模型是成功的。用抗HCV阳性药物利巴韦林(ribavirin)、候选药物苦参素(Oxymatrine)及其类似物DM-122对斑马鱼亚复制子模型进行验证。在反式亚复制子模型中，加入利巴韦林后core的正义RNA明显降低，并呈剂量依赖性，而反义RNA则无明显变化，说明利巴韦林主要抑制core的正义RNA产生，即抑制复制的过程。苦参素和DM-122也都呈剂量依赖性抑制core的正义RNA产生，对core的反义RNA无明显抑制作用。顺式亚复制子模型也得到类似的结果。这些结果初步说明斑马鱼HCV亚复制子模型可以用于抗HCV候选药物筛选。同时

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声明

摘要

论文缩写词中英文对照

第一章 斑马鱼肝脏HCV顺式亚复制子模型的研究

前言

技术路线

材料与方法

1．实验材料

2．实验方法

实验结果

3．1 载体构建

3．2 启动子表达构件的检测

3．3 细胞转染检测亚复制子载体pHHIGI5B的表达

3．4 显微注射斑马鱼的GFP的荧光检测

3．5 Western-Blot检测亚基因组复制模型相关基因的表达

3．6 RT-PCR检测HCV亚基因组复制子在斑马鱼体内的复制功能

3．7 原位杂交验证斑马鱼肝脏HCV亚复制模型的复制功能

3．8 利用HCV相关药物对HCV亚复制子模型的验证

3．9 HCV相关基因表达的变化

3．10 HCV非结构蛋白基因构件对于pHHIGI5B表达构件的作用

讨论

4．1 斑马鱼HCV亚复制子的鉴定

4．2 NS5B单独具有复制功能

4．3 亚基因组复制子可以作为复制的模板

4．4 斑马鱼模型优势

4．5 HCV亚复制子的表型及病理变化

参考文献

第二章 斑马鱼HCV反式亚复制子模型的研究

前言

技术路线

材料方法

实验材料

转基因斑马鱼的显微注射和荧光显微镜观察

RT-PCR

Western blot

整体原位杂交

化合物处理斑马鱼胚胎

实验结果

1．载体构建

2．转基因构件在huh7细胞中表达的验证

3．斑马鱼亚复制系统复制功能的GFP荧光检测

4．RT-PCR和Western blot验证亚复制子过程

5．原位杂交检测HCV亚复制子相关基因的表达

6．HCV相关基因表达的变化

7．利用HCV相关药物对HCV亚复制子模型的验证

8．HCV非结构蛋白构件对斑马鱼亚复制子的作用

讨论

1．反式亚复制子的鉴定

2．3(')NTR和5(')NTR对于复制的关键作用

3．HCV亚复制子影响基因表达

4．IRES、core蛋白和NS5B蛋白的组织定位

参考文献

论文结论

综述

个人简历

附录

致谢