联合应用肢体远隔缺血后处理和七氟烷后处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用及其机制的实验研究

摘要

背景：
　　 缺血再灌注损伤(ischemiareperfusioninjury)的概念是在1960年由等Jennings首次提出，此后该问题成为了困扰医学工作者的一个难题。为了减轻心肌缺血再灌注损伤并最终缩小心肌梗死面积，在临床上和实验研究中均采取了多种干预措施。其中缺血预处理(ischemiapreconditioning)强大的心肌保护作用已得到公认，但临床缺血事件的不可预测性使其更多地是停留在了理论层面。除了短暂缺血之外，多种刺激均可诱发缺血预处理样保护作用。吸入麻醉药七氟烷后处理的心肌保护作用已经在动物和人体研究中得到了证实，七氟烷后处理的主要优点是操作简单和实施容易，并且能够与其他多种心肌保护干预措施联合应用，对于减轻心肌缺血再灌注损伤是一种极具临床应用前景的干预措施。肢体远隔缺血后处理(limbremoteischemicpostconditioning)是通过在上肢或下肢等部位实施远隔缺血刺激，以保护心肌对抗缺血再灌注损伤。肢体远隔缺血后处理的主要优点是实施简单、无需有创操作和不需要额外的费用，具有广阔的临床应用前景。
　　 低氧诱导因子1（hypoxia-induciblefactor1,HIF-1）能够在转录水平调节多种基因的表达，在细胞和组织缺血适应过程中发挥着至关重要的作用。其下游基因血红素氧化酶1(Hemeoxygenase1，HO-1)和诱生型一氧化氮合酶(induciblenitricoxidesynthase，iNOS)具有保护心肌对抗缺血再灌注损伤的作用。丝氨酸／苏氨酸激酶Akt和细胞外调节蛋白激酶(extracellularregulatedproteinkinases，ERK1/2)是再灌注损伤救援激酶途径（reperfusioninjurysalvagekinasepathway，RISK途径）的重要组成成分，是各种不同干预措施发挥心肌保护作用的交汇点。在缺血再灌注过程中，RISK途径激活能够对心肌损伤产生强大的保护作用。
　　 本实验从临床应用出发，拟观察联合应用两种极具应用前景的干预措施—七氟烷后处理和肢体远隔缺血后处理能否获得有益的协同性心肌保护作用。同时对缺血缺氧过程中关键转录因子HIF-1的表达情况以及RISK途径的激活情况进行观察，以初步探讨这两种干预措施发挥作用的机制。全部实验共分三个部分：
　　 第一部分：联合应用肢体远隔缺血后处理和七氟烷后处理组处理对心肌缺血再灌注损伤的保护作用
　　 采用8周龄、体重250～320g的健康SpragueDawley(SD)大鼠建立在体心肌缺血再灌注损伤模型，共分六个实验组（每组10只大鼠）：空白对照组（CON组）、缺血再灌注损伤组（IR组）、缺血预处理组（IPC组）、肢体远隔缺血后处理组(LRIPOC组)、七氟烷后处理组（SEVPOC组）以及联合应用肢体远隔缺血后处理和七氟烷后处理组（COMBINE组）。所有大鼠开胸后采用5-0丝线将冠状动脉左前降支(leftanteriordescendingcoronaryartery，LAD)套扎做成活结。除CON组之外，所有大鼠均接受阻断LAD局部心肌缺血30min和开放LAD心肌血流再灌注120min的处理。IR组不采取任何其他措施；IPC组结扎LAD前进行3个循环（每个循环为5min缺血-5min再灌注）的缺血预处理，总处理时间为30min;LRIPOC组在心肌缺血15min时采用止血带结扎大鼠双侧后肢造成缺血10min，并在再灌注前5min开放后肢血流灌注；SEVPOC组在开放LAD实施再灌注前5min经小动物麻醉机的挥发罐吸入1MAC的七氟烷，直至再灌注后5min;COMBINE组在心肌缺血15min时采用止血带结扎大鼠双侧后肢造成肢体缺血10min，再灌注前5min开放后肢血流灌注，并吸入1MAC的七氟烷，直至再灌注后5min。实验过程中维持大鼠直肠体温在37～38℃范围内，连续监测心率(heartrate，HR)、收缩压(systolicbloodpressure，SBP)、舒张压(diastolicbloodpressure，DBP)、平均动脉压(meanarterialpressure，MAP)和Ⅱ导联ECG，并计算HR和SBP的乘积(rate-pressureproduct，RPP)作为心肌氧耗指数。记录实验中心律失常情况并进行评分。在再灌注120min时抽取动脉血标本，采用ELISA试剂盒检测大鼠血清乳酸脱氢酶(lacticdehydrogenase，LDH)、肌酸激酶心肌型同工酶(creatinekinaseMBisoenzyme，CK-MB)和心肌肌钙蛋白Ⅰ(cardiacTroponin-Ⅰ，cTnⅠ)，并采用伊文思蓝和氯化三苯基四氮唑(TTC)双重染色测定梗死面积(infarctsize，IS％)。
　　 排除实验中不合格的大鼠，最终共有49只大鼠纳入实验，其中CON组9只，IR组、LRIPOC组、SEVPOC组、COMBINE组个IPC组各8只。各组大鼠的一般情况、缺血面积占左心室比值各组间比较差异均无统计学意义。
　　 与IR组相比，LRIPOC组、SEVPOC组和COMBINE组再灌注初期发生心律失常的动物数有所减少和心律失常的持续时间有不同程度的缩短，但是差异无统计学意义。与IPC组相比，IR组、LRIPOC组、SEVPOC组和COMBINE组再灌注初期发生心律失常的动物数显著增多，心律失常持续时间和心律失常评分明显升高。
　　 血清LDH浓度的总体组间比较差异有显著统计学意义(F=51.503，P＜0.01)。与CON组相比，IR组、LRIPOC组、SEVPOC组、COMBINE组和IPC组血清LDH浓度明显升高；与IR组相比，LRIPOC组、SEVPOC组、COMBINE组和IPC组血清LDH浓度明显降低；与IPC组相比，COMBINE组血清LDH浓度无显著统计学差异，但LRIPOC组和SEVPOC组血清LDH浓度明显升高；LRIPOC组和SEVPOC组血清LDH浓度比较差异无显著统计学意义；与COMBINE组相比，LRIPOC组和SEVPOC组血清LDH浓度明显升高。
　　 血清CK-MB浓度的总体组间比较差异有显著统计学意义（F=32.244，P＜0.01）。与CON组相比，血清CK-MB浓度在IPC组和COMBINE组无显著统计学差异，在IR组、LRIPOC组和SEVPOC组明显升高；与IR组相比，LRIPOC组、SEVPOC组、COMBINE组和IPC组血清CK-MB浓度明显降低；与IPC组相比，LRIPOC组和SEVPOC组血清CK-MB浓度的明显升高；与COMBINE组相比，LRIPOC组和SEVPOC组血清CK-MB浓度无显著统计学差异。
　　 血清cTnI浓度的总体组间比较差异有显著统计学意义(F=81.511，P＜0.01)。与CON组相比，IR组、LRIPOC组、SEVPOC组、COMBINE组和IPC组血清cTnI浓度明显升高；与IR组相比，LRIPOC组、SEVPOC组、COMBINE组和IPC组血清cTnI浓度明显降低；与IPC组相比，血清cTnI浓度在COMBINE组无显著统计学差异，在LRIPOC组和SEVPOC组明显升高；LRIPOC组和SEVPOC组血清cTnI浓度比较差异无显著统计学意义；与COMBINE组相比，LRIPOC组和SEVPOC组血清cTnI浓度明显升高。
　　 各组的心肌梗死面积（IS%值）为：CON组，（3.7±3.4）%；IR组,（64.2±13.6））%;LRIPOC组，(45.8±15.6)%;SEVPOC组，(43.6±9.7)%;COMBINE组，(30.9±11.3)%；IPC组，（22.0±5.0）%。IS%值的总体组间比较差异具有显著统计学意义(F=33.333，P＜0.01)。心肌梗死面积两组之间的比较结果如下：与CON组相比，IR组、LRIPOC组、SEVPOC组、COMBINE组和IPC组心肌梗死面积明显增大；与IR组相比，LRIPOC组、SEVPOC组、COMBINE组和IPC组心肌梗死面积明显缩小；与IPC组相比，心肌梗死面积在COMBINE组无显著统计学差异，在LRIPOC组和SEVPOC组明显增大；与COMBINE组相比，LRIPOC组和SEVPOC组心肌梗死面积明显增大。
　　 第二部分：HIF-1在联合应用远隔缺血后处理和七氟烷后处理心肌保护作用中的地位
　　 采用8周龄、体重250～320g的健康SD大鼠建立在体心肌缺血再灌注损伤模型，即结扎大鼠LAD实施局部心肌缺血30min后开放LAD实施心肌血流再灌注60min。共分五个实验组（每组5只大鼠）：缺血再灌注损伤组（IR组）、缺血预处理组（IPC组）、肢体远隔缺血后处理组（LRIPOC组）、七氟烷后处理组(SEVPOC组)以及联合应用肢体远隔缺血后处理和七氟烷后处理组（COMBINE组）。实验过程中维持大鼠直肠温度在37～38℃范围内。再灌注末，再次结扎大鼠LAD，并迅速摘取大鼠心脏。留取结扎线以下颜色灰白的左心室组织作为缺血区心肌组织，留取右心室作为非缺血区心肌组织；同时留取大鼠后肢肌肉（触发远隔缺血后处理的组织）和前肢肌肉（非触发组织）。采用实时定量PCR技术检测（2-ΔΔct法）组织内HIF-1α、HO-1和iNOS基因的表达。
　　 非缺血心肌组织目的基因的表达情况如下：
　　 非缺血区心肌组织内HIF-1αmRNA表达量的均值是按照IR组、LRIPOC组、SEVPOC组、COMBINE组和IPC组的顺序递增。与IR组相比，LRIPOC组、SEVPOC组、COMBINE组和IPC组非缺血区心肌组织内HIF-1αmRNA表达量明显增高；与IPC组相比，LRIPOC组、SEVPOC组和COMBINE组非缺血区心肌组织内HIF-1αmRNA表达量明显降低；与LRIPOC组相比，非缺血区心肌组织内HIF-1αmRNA表达量在SEVOPOC组无显著统计学差异，在COMBINE组明显增高。与SEVPOC组相比，COMBINE组非缺血区心肌组织内HIF-1αmRNA的表达量明显增高。
　　 非缺血心肌组织内HO-1mRNA表达量的均值是按照IR组、LRIPOC组、SEVPOC组、COMBINE组和IPC组的顺序递增。与IR组相比，非缺血心肌组织内HO-1mRNA表达量在LRIPOC组和SEVPOC组无显著统计学差异，在COMBINE组和IPC组明显增高；与IPC组相比，非缺血心肌组织内HO-1mRNA表达量在COMBINE组无显著统计学差异，在LRIPOC组和SEVPOC组明显降低。与LRIPOC组相比，SEVPOC组和COMBINE组非缺血心肌组织内HO-1mRNA表达量明显增高；与SEVPOC组相比，COMBINE组非缺血心肌组织内HO-1mRNA表达量明显增高。
　　 非缺血心肌组织内iNOSmRNA表达量的均值是按照IR组、LRIPOC组、SEVPOC组、COMBINE组和IPC组的顺序递增。与IR组相比，非缺血心肌组织内iNOSmRNA表达量在LRIPOC组无显著统计学差异，在SEVPOC组、COMBINE组和IPC组明显增高；与IPC组相比，非缺血心肌组织内iNOSmRNA表达量在COMBINE组无显著统计学差异，在LRIPOC组和SEVPOC组明显降低；与LRIPOC组相比，非缺血心肌组织内iNOSmRNA表达量在SEVPOC组无显著统计学差异，在COMBINE组明显增高；与SEVPOC组相比，COMBINE组非缺血心肌组织内iNOSmRNA表达量无显著统计学差异。
　　 缺血心肌组织目的基因的表达情况如下：
　　 缺血区心肌组织内HIF-1αmRNA表达量的均值是按照IR组、LRIPOC组、SEVPOC组、COMBINE组和IPC组的顺序递增。与IR组相比，LRIPOC组、SEVPOC组、COMBINE组和IPC组缺血区心肌组织内HIF-1αmRNA表达量明显增高；与IPC组相比，LRIPOC组、SEVPOC组和COMBINE组缺血区心肌组织内HIF-1αmRNA表达量明显降低；LRIPOC组、SEVPOC组和COMBINE组缺血区心肌组织内HIF-1αmRNA表达量比较差异无显著统计学意义。
　　 缺血区心肌组织内HO-1mRNA的表达量的均值是按照IR组、IPC组、SEVPOC组、COMBINE组和LRIPOC组的顺序递增。与IR组相比，LRIPOC组、SEVPOC组、COMBINE组和IPC组缺血区心肌组织内HO-1mRNA表达量明显增高；LRIPOC组、SEVPOC组、COMBINE组和IPC组缺血区心肌组织内HO-1mRNA表达量比较差异无显著统计学意义。
　　 缺血区心肌组织内iNOSmRNA表达量的均值是按照IR组、SEVPOC组、IPC组、COMBINE组和LRIPOC组的顺序递增。与IR组相比，LRIPOC组、SEVPOC组、COMBNE组和IPC组缺血区心肌组织内iNOSmRNA表达量明显增高；与IPC组相比，缺血区心肌组织内iNOSmRNA表达量在SEVPOC组和COMBINE组无显著统计学差异，在LRIPOC组明显增高；与LRIPOC组相比，SEVPOC组和COMBINE组缺血区心肌组织内iNOSmRNA表达量明显降低。
　　 第三部分PI3K/Akt和ERK1/2信号转导通路在联合应用远隔缺血后处理和七氟烷后处理心肌保护作用中的地位
　　 采用8周龄、体重250～320g的健康SD大鼠建立在体心肌缺血再灌注损伤模型，即结扎大鼠LAD实施心肌缺血30min，然后开放LAD实施心肌血流再灌注60min。共分五个实验组（每组5只大鼠）：缺血再灌注损伤组（IR组）、缺血预处理组(IPC组)、肢体远隔缺血后处理组(LRIPOC组)、七氟烷后处理组(SEVPOC组)以及联合应用肢体远隔缺血后处理和七氟烷后处理组（COMBINE组）。实验过程中维持大鼠直肠温度在37～38℃。再灌注期末，再次结扎LAD，并迅速摘取心脏。留取结扎线以下颜色灰白的左心室组织作为缺血区心肌组织，留取右心室作为非缺血区心肌组织。采用Western-Blot技术检测大鼠心肌组织内Akt、磷酸化p-Akt、ERK1/2和磷酸化p-ERK1/2的表达情况，并计算p-Akt与Akt的比值以及p-ERK1/2与ERK1/2的比值。
　　 结果显示：缺血区心肌组织内p-Akt/Akt比值的各组间比较是IR组的数值最小，并按照LRIPOC组、SEVPOC组、COMBINE组和IPC组的顺序递增。缺血区心肌组织内p-Akt/Akt比值的组间比较结果如下：与IR组相比，LRIPOC组、SEVPOC组、COMBINE组和IPC组缺血区心肌组织内p-Akt/Akt比值明显升高；与IPC组相比，LRIPOC组、SEVPOC组和COMBINE组缺血区心肌组织内p-Akt/Akt比值明显降低；与LRIPOC组相比，缺血区心肌组织内p-Akt/Akt比值在SEVPOC组无显著统计学差异，在COMBINE组明显升高；与SEVPOC组相比，COMBINE组缺血区心肌组织内p-Akt/Akt比值明显升高。
　　 非缺血区心肌组织内p-Akt/Akt比值与缺血区心肌组织相似，同样也是IR组的数值最小，并按照LRIPOC组、SEVPOC组、COMBINE组和IPC组的顺序递增。非缺血区心肌组织内p-Akt/Akt比值的组间比较结果如下：与IR组相比，LRIPOC组、SEVPOC组、COMBINE组和IPC组非缺血区心肌组织内p-Akt/Akt比值明显升高；与IPC组相比，非缺血区心肌组织内p-Akt/Akt比值在LRIPOC组和SEVPOC组明显降低，在COMBINE组无显著统计学差异;与LRIPOC组相比，非缺血区心肌组织内p-Akt/Akt比值在SEVPOC组无显著统计学差异，在COMBINE组明显升高；与SEVPOC组相比，COMBINE组非缺血区心肌组织内p-Akt/Akt比值明显升高。
　　 缺血区心肌组织内p-ERK/ERK比值的各组间比较是IR组的数值最小，并按照LRIPOC组、SEVPOC组、COMBINE组和IPC组的顺序递增。缺血区心肌组织内p-ERK/ERK比值的组间比较结果如下：与IR组相比，LRIPOC组、SEVPOC组、COMBINE组和IPC组缺血区心肌组织内p-ERK/ERK比值明显升高；与IPC组相比，缺血区心肌组织内p-ERK/ERK比值在LRIPOC组和SEVPOC组明显降低，在COMBINE组无显著统计学差异；与LRIPOC组相比，缺血区心肌组织内p-ERK/ERK比值在SEVPOC组无显著统计学差异，在COMBINE组明显升高；与SEVPOC组相比，COMBINE组缺血区心肌组织内p-ERK/ERK比值明显升高。
　　 非缺血区心肌组织内p-ERK/ERK比值与缺血区心肌组织相似，同样也是IR组的数值最小，并按照LRIPOC组、SEVPOC组、COMBINE组和IPC组的顺序递增。非缺血区心肌组织内p-ERK/ERK比值的组间比较结果如下：与IR组相比，LRIPOC组、SEVPOC组、COMBINE组和IPC组非缺血区心肌组织内p-ERK/ERK比值明显升高；与IPC组相比，非缺血区心肌组织内p-ERK/ERK比值在LRIPOC组和SEVPOC组明显降低，在COMBINE组无显著统计学差异；与LRIPOC组相比，非缺血区心肌组织内p-ERK/ERK比值在SEVPOC组无显著统计学差异，在COMBINE组明显升高；与SEVPOC组相比，COMBINE组非缺血区心肌组织内p-ERK/ERK比值明显升高。
　　 结论：
　　 通过本实验，我们得出以下结论：
　　 1．在大鼠在体心肌缺血再灌注损伤模型，肢体远隔缺血后处理和七氟烷后处理均能有效减轻心肌缺血再灌注损伤；联合应用两种干预措施能够进一步减轻心肌缺血再灌注损伤。
　　 2．肢体远隔缺血后处理和七氟烷后处理均能诱发系统性保护作用，即两种干预措施均能诱发缺血区心肌、非缺血区心肌、缺血区下肢肌肉内HIF-1α、HO-1和iNOS基因表达加强；联合应用两种干预措施能够进一步增强上述基因的表达。
　　 3．肢体远隔缺血后处理和七氟烷后处理均能诱导Akt和ERK1/2磷酸化，提示这两种干预措施对心肌缺血再灌注损伤的保护作用是通过激活RISK途径实现的。
　　 低氧诱导因子1(hypoxia-induciblefactor1,HIF-1)是在哺乳动物细胞内广泛表达的一种异源二聚体。在氧含量正常的情况下，HIF-1的α亚基能够被迅速降解，该降解过程在低氧状态下则被抑制，以允许该亚基聚积并进入细胞核内与β亚基结合，反向激活下游100多种目标基因，其中包括影响血管生成、血管反应性改变、血管重塑、血管张力调控、血糖和能量代谢、红细胞生成、铁离子稳态、pH调节、细胞分化和存活、核苷酸代谢、细胞基质代谢和金属运输的基因。因此，在缺氧状态下HIF激活具有保护细胞和改变代谢的重要作用。HIF-1调节是一个复杂的过程，除了氧浓度及氧感受蛋白之外，PI3K/Akt激酶促生存途径可能也在HIF蛋白稳定方面发挥着重要的作用。此外，低氧环境下活性氧生成增多，对HIF-1及其下游基因的转录是必需的。自2003年Cai等首次报道HIF-1具有心肌保护作用以来，随后不断有研究表明HIF-1在间断性缺氧、缺血预处理和缺血后处理过程中发挥着重要的作用，多种能够激活HIF-1的药物（氯化钴、吸入麻醉药、脯氨酸羟化酶抑制剂）等均具有心肌保护作用。此外，通过分子生物学方法激活HIF-1亦能发挥心肌保护作用。虽然目前尚无法确定HIF激活后是通过哪种特异性机制来影响缺血再灌注过程中细胞的存活，但是很可能是通过多种途径（包括抗氧化酶、血管生成、细胞死亡途径、抗细胞凋亡途径和其他多种功能）而发挥作用的。