经动脉灌注LV-mIL12转染大鼠带蒂SIEA皮瓣对在体乳腺癌SHZ-88细胞生长影响的研究

摘要

基因治疗作为一种前沿的治疗手段在肿瘤治疗中发挥重要作用，而靶向基因治疗由于其良好的、有效的定向治疗作用，极低的全身反应，成为目前基因治疗研究的热点。皮瓣是整形外科的常用工具，在难愈性创面及体表肿瘤切除后的修复重建过程中发挥重要作用。通过对皮瓣进行基因修饰，使其在肿瘤创面修复中兼具抗肿瘤作用，是整形外科领域的进一步拓展。目前应用皮瓣的靶向基因治疗在整形外科领域的研究刚刚起步，相关文献报道较少。本课题在大鼠带蒂腹壁浅动脉皮瓣(Superficialinferiorepigastricarteryflap，SIEAflap)模型的基础上，深入探讨慢病毒载体(Lentivirus，LV)介导外源基因增强型绿色荧光蛋白(Enhancedgreenfluorescentprotein，EGFP)经动脉介入灌注转染复合组织瓣的可行性、安全性并对其转染条件作出评价，并首次将抗肿瘤因子白介素12与慢病毒载体结合，经动脉灌注于皮瓣中，转移于局部肿瘤创面，观察其抗肿瘤效果。本课题由以下四个部分组成：
　　 1、大鼠带蒂SIEA皮瓣经动脉灌注模型的制备
　　 根据我们的前期研究结果，通过灌注美兰对大鼠SIEA皮瓣血供系统进行进一步确认、研究，设计完善的手术步骤。设计大鼠带蒂SIEA岛状皮瓣，通过暂时夹闭其它分支血供，形成一封闭回路，并经SIEA灌注PBS观察对皮瓣存活的影响。结果显示，当皮瓣缺血时间在120min时，经此操作灌注PBS术后SIEA皮瓣愈合正常，光镜下检测中性粒细胞计数与对照组相比无显著差异(P＞0.05)。
　　 2、慢病毒载体介导示踪基因EGFP(LV-EGFP)经动脉灌注转染大鼠带蒂SIEA皮瓣的研究
　　 体外转染皮瓣中的主要成分细胞：大鼠主动脉内皮细胞(Rataorticendothelialcell，RAEC)、大鼠的皮肤成纤维细胞(Ratdermalfibroblast，RDF)、人的皮肤成纤维细胞(Humandermalfibroblast，HDF)、人脐静脉内皮细胞(Hurmanumbilicalveinendothelialcell，HUVEC)，观察不同时间、不同感染复数(Multiplicityofinfection，MOI)下的转染效率和基因表达水平，寻找最佳转染复数及转染时间。结果显示，对于HDF、HUVEC，LV-EGFP在MOI=50即可有50％以上感染率，在MOI=200时感染率可达到80%以上。对于RDF和RAEC，在MOI=200时可有70%感染率。因此，在MOI=200时对所有的细胞均具有较高的感染率，且不影响细胞活力。对于HDF和HUVEC，在MOI=200时感染2h即可达到满意效果。对于RDF和RAEC感染时间越长越好（12h之内），感染2h基本可以保证感染率在50%以上。
　　 慢病毒介导EGFP经动脉灌注转染大鼠带蒂SIEA皮瓣的研究：实验大鼠依据不同灌注液：LV-EGFP(1.0×108TU/ml、5.0×108TU/ml、1.0×109TU/ml)、PBS，随机分为4组。按第一部分所诉，经动脉灌注转染大鼠带蒂SIEA皮瓣120min。术后第7、14、21、28、40天对外源基因在各组SD大鼠带蒂SIEA皮瓣的表达和分布情况进行评价。结果显示：PBS（A组）和LV-EGFP1.0×108TU/ml（B组）、LV-EGFP5.0×108TU/ml（C组）不能有效转染皮瓣。1.0×109TU/ml（D组）可以有效转染皮瓣，在术后40天仍有表达，对肝、肾无影响。
　　 3、目的基因mIL12(murineInterleukin-12，mIL12)过表达慢病毒载体构建及功能检测
　　 选取具有抗肿瘤作用的IL12作为目的基因，以pORF-mIL-12为模板，PCR调取目的基因，与表达载体重组，采用三质粒慢病毒包装系统构建重组白介素12慢病毒(LV-mIL-12)。以构建好的LV-mIL-12感染人及大鼠皮肤成纤维细胞(HDF、RDF)、血管内皮细胞(HUVEC、RAEC)，检测mIL-12过表达及生物活性。结果显示：成功构建了白介素12重组慢病毒包装质粒，能在细胞内表达。LV-mIL-12可以有效感染皮瓣的主要几种细胞，并分泌有生物活性的mIL-12。
　　 4、LV-mIL12经动脉灌注转染大鼠带蒂的SIEA皮瓣对大鼠SH2-88乳腺癌细胞的影响
　　 行大鼠SH2-88乳腺癌细胞皮瓣皮下接种法建立大鼠乳腺癌模型，将SD大鼠经动脉灌注液不同：LV-mIL12、LV-EGFP、PBS随机分为三组。按前文所述制备SIEA岛状皮瓣，经动脉灌注不同灌注液，分别于术后的第1～40天，观察负瘤鼠生长情况、SIEA皮瓣成活情况及局部瘤体生长情况。结果显示：在术后的28天，ELISA检测实验组皮瓣中央及皮瓣周围均有mIL12表达，皮瓣中央处表达量＞皮瓣周围＞对照组。经动脉灌注LV-mIL12转染大鼠带蒂SIEA皮瓣在早期（7～15天）抑制了局部肿瘤细胞的生长。但到第20天后肿瘤生长实验组与对照组基本持平，肿瘤体积不再明显长大。
　　 综上所述，本实验建立了操作简便、稳定的大鼠带蒂SIEA皮瓣经动脉灌注研究模型。证实慢病毒载体可以携带外源基因EGFP经动脉灌注转染大鼠带蒂SIEA皮瓣。通过三质粒包装法成功构建了白介素12重组慢病毒包装质粒，构建的LV-mIL-12可以有效感染皮瓣的主要几种细胞，并分泌有生物活性的mIL-12。LV-mIL-12经动脉灌注大鼠带蒂SIEA皮瓣，可以在皮瓣及其周围组织中表达。LV-mIL12转染的大鼠带蒂SIEA皮瓣在早期（7～15天）抑制了局部肿瘤细胞的生长。

目录

主要缩略词英一中文对照表

前言

文献综述

第一部分 大鼠带蒂SIEA皮瓣经动脉灌注模型的制备

实验材料

实验方法

术后观察及取材

统计学处理

结果

讨论

结论

第二部分 慢病毒载体介导目的基因EGFP经动脉灌注转染大鼠带蒂SIEA皮瓣的研究

携带增强型绿色荧光蛋白的慢病毒载体(LV-EGFP)分别对体外培养大鼠主动脉内皮细胞、皮肤成纤维细胞，人的血管内皮细胞、皮肤成纤维细胞转染效率的观察

实验材料与方法

结果

讨论

结论

LV-EGFP经动脉灌注大鼠带蒂的SIEA皮瓣的研究

实验材料

实验方法

术后检测方法

结果

讨论

结论

第三部分 目的基因mIL12过表达慢病毒载体构建[GC091739／mIL12(p35p40)]及功能检测

mIL12过表达慢病毒载体构建

实验流程

实验材料

慢病毒载体的线性化

目的基因片段的获得

重组克隆制备

阳性克隆的PCR鉴定

阳性克隆测序结果及结果分析：

Western Blot检测目的质粒蛋白表达结果

慢病毒滴度检测

讨论

结论

目的基因(LV-mIL12)功能检测

材料与方法

结果

讨论

结论

第四部分 LV-mIL12经动脉灌注转染大鼠带蒂的SIEA皮瓣对大鼠SHZ-88乳腺癌细胞的影响

大鼠乳腺癌模型的建立

材料和方法

结果

讨论：

结论：

LV-mIL12经动脉灌注转染大鼠带蒂的SIEA皮瓣对大鼠乳腺癌细胞的影响

实验材料和方法

结果：

讨论

结论

全文总结

参考文献

致谢

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