胶原模拟多肽及其对成纤维细胞粘附作用的研究

摘要

胶原是胞外基质的主要成分，具有独特的三螺旋结构。它不仅对组织和器官起支持和保护作用，还参与介导许多生物学过程。这些生物学功能是通过细胞粘附分子与胶原特征结构域的特异性结合来实现的。深入研究胶原特征结构与细胞的相互作用，是胶原作为生物活性材料应用以及开发人工类胶原生物材料的重要基础。胶原模拟多肽(CMP)可以模拟胶原的特征结构，为研究胶原的结构和功能提供了一个新方法。
　　 本研究设计合成了包含类胶原重复序列(Pro-Hyp-Gly)n的CMP21、含整合素α2βi识别序列Gly-Phe-Hyp-Gly-Glu-Arg(GFOGER)的CMP9以及同时包含以上两种序列的CMP27。研究了Ⅰ型胶原和胶原模拟多肽的三螺旋结构及其热稳定性，观察了胶原模拟多肽对成纤维细胞的粘附作用，阐明了两种序列对细胞粘附的不同影响作用。主要研究工作如下：
　　 1．胶原及胶原模拟多肽三螺旋结构及热稳定性研究
　　 通过圆二色谱(CD)表征了胶原及胶原模拟多肽的三螺旋结构及其热稳定性，CD谱结果显示，仅有整合素识别位点序列的CMP9不具有三螺旋结构，而CMP21和CMP27能自发形成类似胶原的三螺旋结构。热稳定性研究证实，胶原溶液经温度诱导后发生“螺旋—解旋”的热变性过程，该过程不可逆；CMP21和CMP27溶液温度升高后构象连续发生变化，在一定条件下其热变性过程实现可逆恢复，发生“螺旋—解旋—复旋”的变化过程。
　　 2．胶原及胶原模拟多肽细胞毒性评价
　　 用CCK-8法考察CMP及胶原溶液对L929细胞的毒性作用。结果显示，CMP溶液对已贴壁成纤维细胞生长无抑制作用，未发生明显的细胞毒性反应，其中CMP27组对L929细胞生长有一定的促进作用。
　　 3．物理吸附胶原模拟多肽对成纤维细胞粘附的影响
　　 通过物理吸附固定CMP，利用细胞粘附、竞争抑制、荧光染色等实验证实，三种包被CMP的基底均能在一定程度上促进细胞粘附、生长，具有良好的细胞粘附率和细胞附着形态，其中CMP27具有更好的促粘附效果，可观察到大量的应力纤维及伪足，粘附效果与I型胶原相近。由此认为，胶原三螺旋结构对细胞粘附有促进作用，GFOGER序列对细胞伪足生成及应力纤维形成有支持作用。研究结果初步证实，胶原三螺旋结构与整合素识别位点序列共同作用促进成纤维细胞粘附。
　　 4．壳聚糖膜共价偶联胶原模拟多肽对成纤维细胞粘附的影响
　　 以3-马来酰亚胺基苯甲酸琥珀酰亚胺酯(MBS)为连接臂，将壳聚糖膜与CMP共价偶联。利用核磁共振(1H-NMR)与X-射线光电子能谱(XPS)对样品进行了表征，证实多肽与MB-壳聚糖膜共价偶联成功。细胞粘附等实验说明，MB-壳聚糖浓度对成纤维细胞粘附有一定影响，当MB-壳聚糖浓度为3ng/mm2和6ng/mm2时，粘附效果较好。MB-壳聚糖膜偶联CMP后对L929细胞粘附的促进作用明显增强，偶联CMP27的效果较好，可以观察到长势良好的应力纤维与微绒毛，其粘附效果与吸附胶原的基底近似。以上结果进一步证实，胶原三螺旋结构及整合素识别位点序列共同作用促进成纤维细胞粘附。
　　 综上所述，包含胶原三螺旋结构与整合素识别位点序列的CMP可以有效促进成纤维细胞粘附，可作为表面修饰基团促进α2β1整合素介导的细胞粘附。本研究可为设计以多肽为基础的生物活性材料提供新的研究思路，也为开发以及应用人工类胶原生物材料提供研究基础。

目录

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英文缩略词表

摘要

第一章 绪论

1.1 前言

1.2 胶原的结构和性能

1.2.1 胶原类型及分布

1.2.2 胶原结构特点

1.2.3 温度对胶原结构的影响

1.2.4 胶原的功能

1.3 胶原模拟多肽

1.3.1 胶原模拟多肽结构特点

1.3.2 胶原模拟多肽热稳定性

1.3.3 胶原模拟多肽与细胞粘附作用

1.4 胶原模拟多肽研究及应用

1.4.1 阐明胶原三螺旋的形成机制及特点

1.4.2 研究胶原特征结构与细胞间相互作用

1.4.3 研究全合成胶原替代品作为新型生物材料

1.4.4 研究由甘氨酸错义突变产生的胶原疾病

1.4.5 其他方面的用途

1.5 课题的提出及研究意义

1.5.1 胶原及胶原模拟多肽三螺旋结构及热稳定性研究

1.5.2 胶原及胶原模拟多肽细胞毒性评价

1.5.3 物理吸附胶原模拟多肽对成纤维细胞粘附的影响研究

1.5.4 壳聚糖膜共价偶联胶原模拟多肽对成纤维细胞粘附的影响

主要文献

第二章 胶原模拟多肽结构表征及细胞毒性评价

2.1 前言

2.2 试剂与仪器

2.2.1 细胞株

2.2.2 试剂

2.2.3 仪器和设备

2.3 实验方法

2.3.1 设计合成胶原模拟多肽

2.3.2 常温圆二色谱

2.3.3 变温圆二色谱

2.3.4 胶原模拟多肽复性

2.3.5 L929细胞的复苏与冻存

2.3.6 细胞培养与传代

2.3.7 细胞生长曲线测定

2.3.8 细胞毒性测试

2.4 结果与讨论

2.4.1 胶原及多肽三螺旋结构表征

2.4.2 胶原及多肽变性温度测定

2.4.3 热变性胶原模拟多肽低温复性

2.4.4 L929细胞形貌观察

2.4.5 细胞生长曲线

2.4.6 细胞毒性评价

2.5 小结

参考文献

第三章 物理吸附胶原模拟多肽对细胞粘附的影响

3.1 前言

3.2 试剂与仪器

3.2.1 细胞株

3.2.2 试剂

3.2.3 仪器和设备

3.3 实验方法

3.3.1 培养基及添加因子对细胞粘附的影响

3.3.2 CCK-8法与结晶紫法比较

3.3.3 细胞粘附实验

3.3.4 竞争抑制实验

3.3.5 荧光染色实验

3.3.6 数据处理

3.4 结果与讨论

3.4.1 培养基及添加因子对细胞粘附的影响

3.4.2 CCK-8法与结晶紫法比较

3.4.3 细胞在不同基底上的粘附形态及数量观察

3.4.4 竞争抑制作用

3.4.5 细胞骨架形态观察

3.5 小结

参考文献

第四章 壳聚糖共价偶联胶原模拟多肽对细胞粘附的影响

4.1 前言

4.2 试剂与仪器

4.2.1 细胞株

4.2.2 试剂

4.2.3 仪器和设备

4.3 实验方法

4.3.1 壳聚糖纯化

4.3.2 MB-壳聚糖合成及表征

4.3.3 MB-壳聚糖膜浸出液pH值测定

4.3.4 MB-壳聚糖膜偶联胶原模拟多肽

4.3.5 MB-壳聚糖浓度对细胞粘附的影响

4.3.6 免疫荧光染色实验

4.3.7 数据处理

4.4 结果与讨论

4.4.1 MB-壳聚糖表征结果

4.4.2 pH值检测结果

4.3.3 X-射线光电子能谱分析

4.3.4 MB-壳聚糖膜偶联胶原模拟多肽对细胞粘附的影响

4.3.5 激光共聚焦显微镜观察细胞骨架及粘着斑

4.5 小结

参考文献

全文总结

致谢