软骨组织工程种子细胞应用策略及耳廓软骨组织构建研究

摘要

研究背景及意义：
　　 耳廓软骨组织工程为耳软骨缺损的修复重建提供了新的治疗思路，其中种子细胞是限制其发展及临床应用的瓶颈之一。目前，构建组织工程软骨主要通过三种方式来实现：(1)单独应用各种来源的软骨细胞；(2)单独应用成软骨诱导后的间充质干细胞（Mesenchymalstemcells，MSCs）；(3)将软骨细胞与MSCs混合共培养。上述三类种子细胞应用方案从细胞生物学基础与临床应用的角度上讲各存利弊，但目前尚缺乏关于此类问题的深入探讨；此外，针对先天性小耳畸形，自体残耳组织是外耳重建重要的种子细胞来源，目前对残耳组织来源细胞及其软骨构建系统化的研究较少，确立最佳的种子细胞应用策略能够为耳廓软骨组织工程突破目前困境及发展未来应用提供理论基础和技术支持。
　　 研究目的：
　　 1、通过在组织学、基因表达及生物学功能等方面系统比较单纯应用软骨细胞、软骨细胞与BMSCs混合共培养、BMSCs成软骨诱导三类种子细胞应用方案，确立构建弹性软骨最佳的种子细胞应用策略并探讨其构建耳廓形态软骨的可行性。
　　 2、通过分析残耳软骨细胞的体外增殖、表型变化、细胞组织的量效关系以及研究传代、诱导对其体内成软骨能力的影响，确立基于残耳软骨细胞的种子细胞应用策略及其构建耳廓形态软骨的可行性。
　　 研究内容：
　　 1．不同种子细胞及应用方案构建组织工程软骨
　　 1.1、比较不同组织来源软骨细胞构建组织工程软骨的差异
　　 方法：选择耳廓和关节两种不同组织来源的软骨细胞接种PGA/PLA支架构建组织工程软骨组织，在其体外和体内的不同构建阶段，通过组织学检测进行观察，比较两组构建物是否因细胞的组织来源不同而存在差异。
　　 结果：耳廓和关节来源的软骨细胞构建的软骨组织在体外未发现组织学水平的差异，但植入皮下6周后均恢复了各自的生物学特性，关节软骨细胞组发生了部分骨化，耳廓软骨细胞组出现了弹性纤维的阳性着色。
　　 小结：体外构建的组织工程软骨植入体内后能恢复软骨细胞组织来源的特性，可在皮下构建与软骨细胞来源类型相同的组织工程软骨。
　　 1.2、比较三类种子细胞应用方案构建组织工程软骨的差异
　　 方法：系统性比较单独应用耳廓软骨细胞、单独应用骨髓间充质干细胞(Bonemarrowmesenchymalstemcells，BMSCs)并对其进行成软骨诱导、以及耳廓软骨细胞与BMSCs混合共培养构建的组织工程软骨在组织学、基因表达及生物力学功能方面存在的差异。
　　 结果：复合物在植入体内6周后，BMSCs诱导组不仅不能构建弹性软骨组织而且发生了明显的骨化，COL10A1、MMP13、ALPL的表达较其余两组出现显著升高；耳廓软骨细胞与BMSCs混合共培养组不仅可保持稳定的软骨表型，而且相较单纯耳廓软骨细胞组其弹性纤维更为均质、密集，弹性模量也更高且与生理耳廓软骨无统计学差异，COL9A1、COMP、DCN、LOXL2的表达也有统计学意义的升高。此外，共培养构建的软骨组织其Dlk1与Ki67的表达也高于单纯耳廓软骨细胞组。
　　 小结：耳廓软骨细胞与BMSCs混合共培养是目前构建弹性软骨组织最佳的种子细胞应用策略，其构建的弹性软骨具备更密集的弹性纤维和更高的弹性模量，并且可延续干细胞带来的增殖与分化能力。
　　 1.3、软骨细胞与骨髓间充质干细胞共培养构建耳廓软骨
　　 方法：将猪自体耳廓软骨细胞与BMSCs以5∶5的比例混合接种于预成型的耳廓形态PGA/PLA支架上，体外培养10周，植入猪耳后皮下20周后进行软骨相关检测。
　　 结果：猪耳廓软骨细胞与BMSCs以5∶5的比例混合共培养能够在体外构建良好形态及弹性的耳廓软骨，在植入大动物体内20周后仍然能够稳定存活，且其组织学与弹性相较生理耳廓软骨无明显差异，但是最终难以维持耳廓的精细形态。
　　 小结：在大动物体内实验中，共培养构建的耳廓软骨能够稳定存活20周，但因不能对抗皮肤收缩力最终难以维持耳廓的精细形态。
　　 2．先天性小耳残耳软骨细胞构建组织工程软骨
　　 2.1、残耳软骨细胞的增殖、表型变化及量效关系研究
　　 方法：通过对大量残耳组织进行称重和细胞分离计数，计算残耳组织的初始细胞获得率；通过绘制生长曲线和细胞计数研究4代以内残耳软骨细胞在bFGF影响下的增殖能力及扩增倍数；在细胞和基因水平检测传代对残耳软骨细胞表型的影响；并通过大量软骨相关基因谱的筛查比对残耳软骨细胞与正常耳软骨细胞在基因水平的异同。
　　 结果：残耳组织的初始细胞获得率为(3.90±1.27)×106/g;残耳软骨细胞在bFGF的刺激下增殖能力明显提高,4代以内增殖能力未见差别，且扩增至P4代能够达到(328.4±50.4)倍的增殖效率；但是，同样条件下扩增至P3代的残耳软骨细胞其番红O染色、Ⅱ型胶原的基因表达已较弱，至P4代基本检测不到；此外，残耳软骨细胞在基因水平除个别个体的COL2A1成熟型异构体COL2A1V2及COL9A1的表达偏低外，与正常耳软骨细胞相较未见明显差异。
　　 小结：残耳组织来源细胞与正常耳廓软骨细胞相比在基因水平未见明显差异，在bFGF培养下增殖到P3代仍可维持一定程度的软骨表型且能达到构建常人体积耳廓软骨的细胞数量（以获得500mg残耳组织计算）。
　　 2.2、体外传代及诱导对残耳软骨细胞体内成软骨能力的影响
　　 方法：将P3-P8代残耳软骨细胞各自接种PGA/PLA支架进行软骨组织构建，根据组织学、基因表达和生物力学结果分析体外传代及诱导对其最终体内成软骨能力的影响。
　　 结果：在P3-P8各代次细胞材料复合物中，P4代以前在体外4周可较高表达SOX9和DLK1，并能在体内形成良好的弹性软骨组织；经过体外诱导，P3-P8代的残耳软骨细胞材料复合物均能在体外形成类软骨组织，但DLK1的表达却均显著低于非诱导组，且其体内8周后的成骨现象十分明显。
　　 小结：P4代以前的残耳软骨细胞不经体外诱导虽然不能在体外构建耳廓软骨，但仍可保持良好的体内成软骨能力形成弹性软骨。P3-P8代细胞经体外诱导可以形成类软骨组织，但是其体内的成骨倾向较为严重，DLK1可能在体外成软骨诱导致体内成骨过程中扮演重要角色。
　　 2.3、单例先天性小耳残耳软骨细胞构建常人体积耳廓软骨
　　 方法：将单例病人残耳组织分离的软骨细胞在体外传至P3或P4代，在生长因子、藻酸盐凝胶、旋转培养的体外再分化系统中培养10周后进行软骨相关检测，以体外普通培养（不诱导）作为对照。
　　 结果：利用单例先天性小耳的残耳组织经过细胞扩增和再分化系统培养可以在体外构建常人体积的耳廓形态软骨，所形成的软骨组织结构较接近正常生理软骨组织。
　　 小结：大量增殖的残耳软骨细胞在再分化诱导系统培养下能够在体外构建常人体积的耳廓软骨。
　　 综上所述，本研究以耳廓软骨构建为最终目的，探讨了几种软骨组织工程种子细胞及其应用策略的可行性。明确了耳廓软骨细胞与BMSCs共培养方案在构建弹性软骨方面的优势，首次应用其在体外构建耳廓形态组织工程软骨并进行大动物体内研究。同时，系统研究了残耳软骨细胞构建软骨组织的量效关系及应用方案，并在体外构建常人体积耳廓软骨。这些研究结果为耳廓软骨组织工程的临床应用提供了理论基础和技术支持。