加巴喷丁治疗双侧CCI大鼠神经病理性疼痛机制研究

摘要

前言:
　　神经病理性疼痛在普通人群中的发病率已超5％，是全球重大公共卫生问题之一，其病因机制复杂，尚缺乏有效的治疗措施。在本课题组前期研究中，已发现神经病理性疼痛大鼠脊髓背角miR-203的表达水平显著下降;利用蛋白质组学方法筛选出蛋白磷酸酶1催化亚基β异构体(PPP1CB)等多种蛋白质表达水平发生了改变。PPP1CB是一种与学习记忆等神经功能相关的蛋白催化亚基，可能在神经病理性疼痛机制中发挥着作用。
　　目的:
　　本研究选用双侧坐骨神经结扎大鼠作为神经病理性疼痛模型，利用加巴喷丁对大鼠进行治疗，旨在明确加巴喷丁对bCCI大鼠的治疗效果，以及加巴喷丁治疗对bCCI大鼠脊髓背角PPP1CB的表达影响及其与miR-203之间的关系。
　　方法:
　　48只180-200gSD雌性大鼠，被随机分为4组:
　　①Na(i)ve组(N=12);
　　②SHAM组(N=12):进行大鼠双侧假手术;
　　③bCCI组(N=12):建立大鼠双侧CCI模型;
　　④bCCI+GBP组(N=12):bCCI术前15分钟一次、术后第7天起每日两次，给予加巴喷丁100mg/Kg腹腔注射，连续7天。
　　监测大鼠的体重、机械刺激诱发痛、热刺激诱发痛和冷刺激诱发痛等行为学指标，来判断是否建模成功以及加巴喷丁的镇痛效果。术后第14天处死大鼠，留取脊髓背角(L4-L6)标本，分别利用Real-TimePCR与western-blot检测PPP1CB的mRNA及蛋白质表达水平变化，并进行了生物信息学分析。
　　结果:
　　1.双侧坐骨神经结扎(bCCI)模型大鼠双足热刺激诱发痛痛阈、机械刺激诱发痛痛阈及丙酮法冷刺激缩足反射阈阈值较正常对照组、假手术组显著降低，体重显著下降。术后第7天开始加巴喷丁100mg/Kgbid干预后，bCCI+GBP大鼠体重、双足冷刺激诱发痛阈值与bCCI未干预组无显著差异，而双足热刺激诱发痛阈值、机械刺激缩足反射阈值均较未干预组有显著恢复。
　　2.在双侧坐骨神经结扎模型中，大鼠脊髓背角(L4-L6)PPP1CB蛋白表达水平较正常对照组、假手术组有显著上升，约2倍左右，而PPP1CB mRNA表达水平则显著下降约0.8倍左右。术后第7天开始加巴喷丁100mg/Kgbid干预后，bCCI+GBP组大鼠脊髓背角(L4-L6)PPP1CB蛋白表达水平较未干预组有显著回落，但未恢复到正常对照组、假手术组水平，而PPP1CB mRNA表达水平则较未干预组有显著回升，恢复到与正常对照组、假手术组相同水平。
　　3.利用生物信息学，验证了miR-203对PPP1CB的调控关系，解释了PPP1CB在脊髓背角的差异表达可能是因为miR-203本身对PPP1CB起到负向调控作用，而bCCI大鼠脊髓背角miR-203的减少导致了PPP1CB蛋白表达水平的上升。
　　结论:
　　1.加巴喷丁可以缓解神经病理性疼痛大鼠双足对热敏、机械敏感的症状，但对冷刺激感觉异常无效果。
　　2.加巴喷丁可以改变大鼠脊髓背角PPP1CB的mRNA及蛋白质表达水平。
　　3.大鼠脊髓背角PPP1CB蛋白的表达量上升可能受到了miR-203的调控作用，并可能通过多种途径参与了神经病理性疼痛的发生发展。

目录

声明

英文缩略词表

摘要

前言

技术路线

材料和方法

1．双侧CCI模型

1．1 实验动物和材料

1．2 模型建立

1．3 行为学观察

1．4 体重

1．5 机械刺激诱发痛测定

1．6 热刺激诱发痛测定

1．7 冷刺激诱发痛测定

1．8 处死动物及标本

2．总RNA提取

2．1 实验材料

2．2 组织总RNA提取

2．3 紫外分光光度仪测定RNA浓度与质量鉴定

2．4 琼脂糖电泳鉴定RNA完整性

3．荧光实时定量PCR探究PPP1CB cDNA变化(染料法)

3．1 实验材料

3．2 RNA逆转录成cDNA

3．3 聚合酶链式反应(普通PCR)

3．4 PCR产物分析

3．5 PCR条件的优化

3．6 荧光实时定量PCR

4．Western-blot大鼠脊髓背角蛋白质水平研究

4．1 实验材料

4．2 蛋白样品制备

4．3 蛋白含量测定

4．4 SDS-PAGE电泳

4．5 转膜

4．6 封闭

4．7 免疫反应

4．8 化学发光／显影、定影

5．网络服务器

6．统计学方法

结果

1．双侧CCI模型的建立和行为学检测

1．1 行为学变化

1．2 大鼠体重变化

1．3 大鼠机械刺激缩足反射阈值(MWT)的变化

1．4 大鼠热刺激伤害感受阈阈值的变化

1．5 大鼠丙酮冷刺激缩足反射阈阈值的变化

2．荧光实时定量Real-time PCR结果

2．1 总RNA质量的鉴定

2．2 反转录PCR及普通PCR结果

2．3 Real-Time PCR检测miR-203及PPP1CB基因表达情况

2．4 琼脂糖凝胶电泳检测Real-Time PCR产物扩增情况

3．Western-Blot免疫印记法检测结果

3．1 BSA标准曲线

3．2 曝光结果

3．3 ImageJ分析结果

4．生物信息学结果

讨论

结论

致谢

参考文献

综述1 加巴喷丁治疗神经病理性疼痛的研究进展

综述2 儿童及青少年与神经病理性疼痛