骨髓增生异常综合征铁稳态失衡与骨髓红系无效造血关系的初步研究;伴环状铁粒幼细胞增多的骨髓增生异常综合征SF3B1基因突变意义研究

摘要

第一部分骨髓增生异常综合征铁稳态失衡与骨髓红系无效造血关系的初步研究
　　 [背景]外源性红细胞输注是引起骨髓增生异常综合征(myelodysplasticsyndromes，MDS)患者铁过载的主要原因，但许多MDS患者在接受输血治疗前即存在血清铁蛋白(SF)增高的现象。铁调素(hepcidin)在机体铁稳态调节中发挥核心作用，在重型地中海贫血中已证实骨髓红系无效造血上调转化生长因子15(GDF15)可抑制肝细胞hepcidin的分泌进而引起铁过载，但GDF15在MDS中的表达水平及如何参与hepcidin调节的机制尚未明确。
　　 [目的]本研究通过检测未接受红细胞输注MDS患者hepcidin及其影响因素GDF15、促红细胞生成素(EPO)、低氧诱导因子-1α(HIF-1α)等的表达水平，旨在阐释MDS疾病铁稳态是否失衡，骨髓红系无效造血如何影响铁稳态失衡及铁过载对骨髓红系造血的影响。
　　 [方法]
　　 ①酶联免疫吸附(ELISA)法检测MDS患者血清GDF15及hepcidin表达
　　 ②实时定量Real time PCR检测MDS患者骨髓单个核细胞HIF-1α、抗凋亡因子Bcl-xL mRNA表达水平
　　 ③DCFH-DA探针法及Annexin-V标记MDS患者骨髓红系CD71+细胞，流式细胞术检测CD71+细胞内活性氧(Reactive oxygen Species，ROS)表达水平及凋亡比例的变化，分析SF与ROS及凋亡的关系
　　 ④体外建立枸橼酸铁(FAC)负荷红白血病细胞系K562细胞铁过载模型，流式细胞术分析对照组、N-乙酰半胱氨酸(NAC)联合FAC组、FAC单独处理组间细胞内游离铁(Labile iron pool，LIP)、ROS及凋亡比例的变化，Western-blot法在蛋白水平检测上述三组线粒体凋亡通路相关蛋白表达水平的变化。
　　 [结果]
　　 ①107例未接受红细胞输注MDS患者SF、EPO、hepcidin及GDF15表达水平较40例正常对照显著增高（P值均＜0.001），但反映MDS患者铁调节相对能力的hepcidin/SF比值较正常对照显著减低(P＜0.001)。
　　 ②未接受红细胞输注MDS患者GDF15表达水平与骨髓红系比例、可溶性转铁蛋白受体（sTfR）、转铁蛋白饱和度(ISAT)正性相关(r=0.485，P＜0.001;r=0.285，P=0.018; r=0.242，P=0.038)，与转铁蛋白（TRF）负性相关(r=-0.315，P=0.008)。
　　 ③按照2008 WHO诊断分型分组，RARS患者hepcidin/SF比值较其它亚型显著减低(P=0.011)，SF及ISAT较其它亚型显著增高(P值分别为0.028和0.004)。
　　 未接受红细胞输注MDS患者EPO、HIF-1α mRNA表达水平与hepcidin表达水平负性相关(r=-0.250，P=0.022; r=-0.377，P=0.048)，而SI及SF与hepcidin表达无相关性（P值分别为0.873和0.702）。
　　 hepcidin/SF比值与GDF15表达水平呈负性相关(r=-0.279，P=0.014)，与EPO水平亦负性相关(r=-0.449，P＜0.001);GDF15≥5000pg/ml组hepcidin/SF比值较GDF15＜5000pg/ml组显著减低(P=0.036); EPO≥200mu/ml组hepcidin/SF比值较EPO＜200mu/ml组显著减低(P=0.001)。
　　 多元线性回归模型纳入GDF15、EPO、网织红细胞比例(Ret％)、年龄与WHO诊断分型，GDF15表达水平及WHO诊断分型为hepcidin/SF比值的独立影响因素(β=-0.292,P=0.029;β=-0.390,P=0.006)。
　　 ④将未接受输血MDS患者按照SF分组:SF≥500ng/ml组(n=27)红细胞爆式集落形成单位(BFU-E)较SF＜500ng/ml(n=43)组显著减低(P=0.007)，两组间粒单核细胞集落形成单位(CFU-GM)差异无统计学意义(P=0.190);MDS患者骨髓红系CD71+细胞内ROS水平与SF表达正性相关(r=0.739，P=0.001)，CD71+细胞内ROS水平与其凋亡比例正性相关(r=0.600，P=0.018)。
　　 ⑤1mM枸橼酸铁(FAC)作用24h后细胞内游离铁(LIP)水平升至最高，以此建立红白血病细胞系铁过载模型;FAC组细胞内ROS水平较对照组显著增高(P=0.0006)，凋亡比例较对照组显著增高(P=0.011);N-乙酰半胱氨酸(NAC)联合FAC处理组ROS水平较FAC组显著减低(P=0.014)，凋亡比例较FAC组亦显著减低(P=0.023)。Western-blot显示对照组、NAC+FAC组、FAC组促凋亡蛋白Bax表达水平逐渐增高，抗凋亡蛋白Bcl-2水平逐渐减低，活化caspase-3表达呈升高趋势。
　　 [结论]
　　 ①未接受红细胞输注MDS患者存在铁过载现象，且铁调节相对能力失衡;
　　 ②GDF15可作为反映MDS患者骨髓红系无效造血的有效指标;
　　 ③MDS患者红系无效造血通过EPO、HIF-1α、GDF15共同参与肝细胞hepcidin分泌抑制作用，GDF15对肝细胞hepcidin分泌可能具有直接抑制作用;
　　 ④铁过载可抑制MDS患者骨髓红系干、祖细胞增殖并促进红系前体细胞凋亡，从而加重MDS患者无效造血，该效应与细胞内ROS水平升高密切相关;
　　 ⑤体外实验证实铁过载通过ROS诱导细胞凋亡，NAC通过降低细胞内ROS减弱铁过载诱导的凋亡作用。
　　 第二部分伴有环状铁粒幼红细胞增多的骨髓增生异常综合征患者SF3B1基因突变意义研究
　　 [目的]探讨我国伴环状铁粒幼红细胞(RS)≥15％骨髓增生异常综合征患者(MDS-RS)中SF3B1基因的突变频率及其临床意义。
　　 [方法]对1995.07月～2011.06月就诊于我院的147例MDS-RS患者进行回顾性诊断分析，以同期确诊的144例RCMD患者作为对照组。对104例MDS-RS患者采用基因组DNA聚合酶链反应(PCR)扩增SF3B1基因第13～15号外显子，应用直接测序法检测SF3B1基因13～15外显子突变状态，比较SF3B1突变型与野生型患者的临床及实验室特征，随访患者阐明突变预后意义。
　　 [结果]
　　 ①104例MDS-RS患者SF3B1基因突变总体检出率为53％(55/104)，K700E占所有突变类型67.3％;难治性贫血伴环形铁粒幼细胞增多(RARS)突变率为64％（25/39例），难治性血细胞减少伴有多系发育异常和环状铁粒幼红细胞增多(RCMD-RS)突变率为58％（26/45例），两者突变率均显著高于RAEB-RS(4/20例)患者（P值分别为0.001与0.005），所有突变均为错义突变且集中发生于14及15号外显子。
　　 ②SF3B1基因突变型患者发病年龄较高，血小板计数(PLT)(中位数为157×109/Lvs85×109/L; P=0.007)，平均红细胞体积(MCV)（中位数为104fL vs93fL;P＜0.001），骨髓内RS比例（中位数为42％ vs26％; P＜0.001），骨髓红系细胞比例(中位数为51％ vs44％; P=0.012)均显著高于野生型，而骨髓原始细胞数较野生型显著减低(中位数为0.5％ vs1.5％; P=0.044)。
　　 ③中位随访时间22(1～102)个月，最终140例MDS-RS患者及141例RCMD患者有完整随访资料。SF3B1突变型患者总生存期(OS)显著优于野生型(OS分别为63(95％CI49～77)月与25(95％CI20～30)月;P=0.000）。采用Kaplan-Meier生存分析对影响预后的参数进行筛选，将性别、年龄、SF3B1突变、血红蛋白、PLT、MCV、IPSS染色体核型分组、WHO诊断分型及治疗纳入COX多因素模型，结果显示SF3B1基因突变仍为影响预后的独立因素(HR=2.894，P=0.007)。
　　 [结论]
　　 ①我国MDS-RS患者SF3B1基因突变率高达53％，其中RARS及RCMD-RS患者突变率显著高于其它亚型患者，该突变为其特异的分子生物学标志;
　　 ②SF3B1基因突变型MDS-RS患者具有相对独立的临床及实验室特征;
　　 ③SFB31基因突变为影响MDS-RS预后的独立因素，突变型患者预后较好。

目录

第一部分 骨髓增生异常综合征铁稳态失衡与骨髓红系无效造血关系的初步研究

摘要

前言

实验材料和仪器

实验方法

实验结果

讨论

参考文献

第二部分 伴有环状铁粒幼红细胞增多的骨髓增生异常综合征患者SF3B1基因突变意义研究

摘要

前言

实验材料与仪器

实验方法

实验结果

讨论

参考文献

综述

附录一 常见英文缩写

附录二：在学期间发表论文及会议报告

声明

致谢