中国西南地区妇女宫颈标本中人乳头瘤病毒的分子流行病学研究

摘要

感染人乳头状瘤病毒(HPV)是导致富颈癌的一个重要因素。宫颈癌在全球每年新发病例约50万，死亡例数约25万，在妇科肿瘤中发病率居第2位。HPV主要感染皮肤以及粘膜鳞状上皮，分为2大类，皮肤型和粘膜型。粘膜型主要感染人泌尿生殖道的黏膜上皮，导致与泌尿生殖器官相关的多种疾病。根据与癌症发生的关系大小，粘膜型HPV分为高危型(HR)和低危型(LR)。高危型主要有HPV-16，18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59和66型;低危型主要有HPV-6，11，40，42，43，44，54，61，70，72，81型。分子流行病学和病毒学研究发现，HPV感染宫颈可发展为宫颈癌与HPV型别有关。在不同国家和地区HPV感染率及其型别分布存在差异，具有很强的地域性，其与宫颈癌相关的型别、E6/E7基因变异情况也不同。关于宫颈癌疫苗的研究，预防性疫苗主要以L1基因为主，治疗性疫苗主要以E6/E7基因为靶点。到目前为止，对于人乳头状瘤病毒(HPV)在西南地区妇女中的流行情况，优势型别以及优势型别的E6/E7基因变异情况的报道很少。本研究旨在探讨中国西南地区妇女HPV感染的分布规律以及HPV-16、18和58型E6、E7基因的变异情况，为评价HPV疫苗接种情况以及筛查与癌症相关的潜在风险因素提供了研究数据，并为下一步研究以HPVE6和E7蛋白为基础的治疗性疫苗提供了重要的实验数据。
　　本论文以中国西南地区妇女门诊病人中正常以及炎症细胞人群（ASC-US，即意义不明的不典型鳞状细胞）和宫颈癌患者为研究对象，调查了该区HPV亚型的感染以及分布。对采集获得2000例妇科门诊宫颈脱落细胞样品以及74例宫颈癌标本开展相关的研究。通过提取基因组DNA，以MY09/MY11为外引物，GP5+/GP6+为内引物，采用nest-PCR法对样品HPV-DNA高变区L1区的相应基因进行扩增、测序和分型，并对优势型别进行E6和E7基因特异性扩增，测序。E6和E7基因测序后用软件Geneious4.8.4进行比对，将比对的序列上传至GenBank获得基因登录号。用软件Mega4.1使用邻接法(NeighborJoining，NJ)，对E6和E7基因完成进化树分析。应用PAML4.0软件内的位点模型分析E6和E7基因经受正向选择的位点，依卡方x2分布进行似然比值检验。
　　结果表明，中国西南地区妇女ASC-US人群中HPV的流行高危型主要型别为HPV-16型，HPV-58型，HPV-33型;低危型主要为HPV-6型，HPV-11型。宫颈癌患者中以HPV-16，HPV-18型为主。ASC-US人群易感人群为31岁-40岁妇女，宫颈癌患者的易感人群比上述年龄推后10岁。而且，宫颈鳞状细胞癌患者中，HPV-16型为主要感染亚型。通过对E6/E7基因变异分析发现，中国西南地区妇女中HPV-16型E6基因最常见的突变位点为T178G或T178A，即D25E;E7基因常见突变位点为A647G(N29S)和同义突变点T846C。E6/E7基因序列联合分析发现HPV-16型突变位点E6-D25E与E7-N29S-T846C为连锁突变位点，并且为常见变异型。HPV-58型E6基因最常见的突变位点为K93N，E7基因常见突变位点为同义突变点T744G和非同义突变点T20I，G41R，G63S，G63D和V77A，且突变T20I-G63S和突变G41R-G63D为连锁突变位点。HPV-18型E6基因发现T485C和C549A两个同义突变点。
　　进化树分析表明中国西南地区流行的HPV-16E6/E7变异体主要为亚洲型变异体，没有发现非洲1型变异体和非洲2型变异体。HPV-58型E6/E7基因序列起源于东南亚分支。
　　选择压力分析表明，虽然发现HPV-16型E6基因正选择突变位点为32E，E7基因正选择突变位点为29S;HPV-58型E7基因63G为正选择位点，但经过LRT检验，差异没有统计学意义，即没有没有证据表明HPV-16型、HPV-58型E6/E7基因受到正选择。

目录

摘要

前言

材料与方法

1．研究对象的筛选

2．样品的收集

3．病毒DNA的提取

4．HPV定型

5．PCR引物的设计与合成

6．PCR扩增

7．序列测定及核苷酸变异分析

8．基因进化树及选择压力分析

研究结果

1．病毒DNA质量鉴定

2．巢式PCR(nest-PCR)结果

3．ASC-US人群HPV流行情况(正常以及炎症细胞)

4．宫颈癌患者HPV流行情况

5．ASC-US人群HPV16型，58型E6和E7基因的突变分析

6．宫颈癌患者HPV16型，18型E6和E7基因的突变分析

讨论

1．中国西南地区妇女HPV流行情况及型别分布

2．中国西南地区妇女中E6／E7基因变异情况

3．意义

小结

参考文献

附录 缩略词语表

致谢

个人简历

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