以HDL受体SR-BI基因3'UTR为靶点的microRNA和小分子化合物的发现及作用机制研究

摘要

过去几十年，人类心血管健康问题得到有效改善，但是，心血管疾病依然是世界范围内最主要的致残和致死性疾病。心血管疾病患者经济负担沉重，社会活动受到限制，生活质量严重下降，更有甚者饱受长期残疾之苦，容易导致过早死亡。采取有效措施，促进心血管疾病的预防和治疗有重大的临床和社会效益。动脉粥样硬化是大多数心血管疾病的病理学基础，所以急需发展新的更好的抗动脉粥样硬化策略。大量流行病学研究表明，血浆高密度脂蛋白浓度与动脉粥样硬化发病风险呈负相关。高密度脂蛋白介导的胆固醇从外周组织到肝脏的运输，称为胆固醇的逆向转运，是维持体内胆固醇平衡的一个主要途径。选择性胆固醇的摄取是受体介导的高密度脂蛋白胆固醇酯直接转运的主要机制。SR-BI作为高密度脂蛋白受体介导肝脏和类固醇合成组织选择性摄取血浆高密度脂蛋白胆固醇。肝脏SR-BI过表达能有效促进胆固醇逆转运，减少动脉粥样硬化。因此，SR-BI被认为具有明显的抗动脉粥样硬化功能。SR-BI可能成为预防或治疗动脉粥样硬化性疾病的重要靶点。
　　 在本研究的第一部分，我们考察了参与肝脏SR-BI基因转录后调控和高密度脂蛋白胆固醇选择性摄取调节机制的microRNA。肝细胞HepG2中，miR-185、miR-96和miR-223能显著抑制SR-BI表达，并且分别以31.9％(P＜0.001)、23.9％（P＜0.05）和15.4％(P＜0.05)的比例降低DiI-HDL摄取。它们的反义寡核苷酸抑制剂呈现相反的效应。作用位点缺失后，miR-96，miR-185和miR-223失去调节功能，这进一步确证了它们对SR-BI的调节作用。此外，这几个microRNA还能以协同效应的方式直接作用于SR-BI基因mRNA3'UTR序列。更值得关注的是，高脂饲料喂养的ApoE基因敲除小鼠miR-96和miR-185与SR-BI的表达呈截然相反的变化，SR-BI表达增加，而miR-96和miR-185的表达水平降低。这些实验数据表明，人类肝细胞中，miR-185、miR-96和miR-223可以通过抑制SR-BI的表达来抑制HDL-C选择性摄取。这一发现是肝脏SR-BI基因表达调控的新模式，同时也揭示了microRNA参与胆固醇代谢调节的新机制。
　　 在本研究的第二部分，我们发现和确证了几个具有增强SR-BI基因mRNA稳定性功能的小分子化合物，并明确了它们调节SR-BI表达和功能的作用。我们将人SR-BI基因mRNA3'UTR序列构建在荧光素酶报告基因下游，建立以稳定转染HepG2细胞为基础的高通量筛选模型，筛选3'UTR序列相关的能够显著增强SR-BI基因mRNA稳定性的小分子化合物。筛选条件的优化和模型参数的评价表明该模型符合高通量筛选的要求，合理有效，可用于微生物次级代谢产物库和化合物库的大规模高通量筛选。通过对国家新药（微生物）筛选中心化合物库提供的25755个化合物的多轮筛选，获得6个阳性化合物，筛选阳性率0.23‰。获得的六个阳性化合物均能有效提高肝细胞SR-BI表达和DiI-HDL选择性摄取。进一步研究表明，化合物5172B-41和5238B-63能够有效延长肝细胞SR-BI基因mRNA半衰期，提高SR-BI基因mRNA水平和蛋白表达水平，从而明确了它们增强肝细胞SR-BI基因mRNA稳定性的功能。化合物5172B-41和5238B-63以时间依赖性和剂量依赖性的方式影响SR-BI基因表达和肝细胞对DiI-HDL的选择性摄取。构效关系分析为进一步获得更好活性的候选化合物提供了很多有益参考。本研究获得的阳性小分子化合物具有明确的作用靶点，有可能发展成为新型心血管疾病治疗候选药物或先导化合物，并有助于对SR-BI基因转录后调控机制进行深入研究。

目录

摘要

前言

材料与方法

第一部分 实验材料

1．质粒

2．菌株

3．细胞株

4．实验动物

5．小分子RNA

6．化合物样品

7．PCR引物

8．培养基

9．主要试剂

10．工具酶

11．抗体

12．试剂盒

13．DNA和蛋白质分子量标准

14．其他试剂

15．主要耗材

16．主要仪器

第二部分 实验方法

1．生物信息学分析

2．细胞培养

3．质粒构建

4．细胞转染

5．荧光素酶报告基因表达活性的分析

6．化合物样品的高通量筛选

7．RNA提取

8．逆转录合成cDNA

9．实时荧光定量PCR

10．microRNA的实时荧光定量PCR检测

11．蛋白质印迹法

12．流式细胞术分析细胞表面蛋白表达

13．DiI-HDL摄取活性分析

14．mRNA半衰期测定

15．细胞凋亡和坏死检测

16．动物实验

17．数据统计与分析

参考文献

结果与讨论

第一部分 microRNA对SR-BI的转录后调控机制研究

1．Drosha和Dicer基因沉默对SR-BI基因表达的影响

2．生物信息学分析预测

3．microRNA的筛选与分析

4．microRNA对肝细胞凋亡的影响

5．microRNA结合位点序列保守性分析

6．microRNA对肝细胞HepG2 SR-BI表达的影响

7．microRNA对肝细胞HepG2 DiI-HDL摄取的影响

8．microRNA对肝细胞Bel-7402和HL-7702 SR-BI表达和功能的影响

9．microRNA作用靶点的确证

10．SR-BI在microRNA抑制肝细胞HDL摄取中的作用

11．miR-96，miR-185和miR-223的协同作用

12．microRNA对巨噬细胞SR-BI表达和HDL摄取的影响

13．microRNA和SR-BI与高脂饲喂ApoE敲除小鼠脂代谢

14．microRNA对其它脂代谢相关靶点的影响

15．讨论

16．结论

第二部分 以SR-BI mRNA稳定性为靶点的新型抗动脉粥样硬化药物的筛选及其作用机制研究

1．SR-BI 3’UTR对荧光素酶基因mRNA半衰期的影响

2．高通量筛选模型的建立和应用

3．阳性化合物对肝细胞SR-BI表达及HDL摄取的影响

4．化合物5172B-41和5238B-63的量效关系

5．化合物5172B-41和5238B-63的时效关系

6．化合物5172B-41和5238B-63对mRNA半衰期的影响

7．构效关系分析

8．讨论

9．结论

参考文献

文献综述

附录

致谢

声明