利用激光显微切割联合质谱蛋白质组学鉴定系统性淀粉样变类型

摘要

背景及目的: 福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)标本结合蛋白质组学技术可以利用院内丰富的病理组织资源进行研究，但目前尚无标准的蛋白提取策略。我们应用当前五种常用的蛋白提取液，对大鼠不同脏器的FFPE微切标本进行蛋白组成分析，从而确定出最佳的能用于后续淀粉样变质谱分型的蛋白提取液。 淀粉样变是由致淀粉样变蛋白在细胞外异常沉积所导致的一组疾病，不同亚型的发病机制、疾病进程、治疗手段及预后均有显著差异，因而准确的系统性淀粉样变分型是疾病治疗的先决条件。由于抗体类型有限、标本处理后抗原表位丢失和杂质蛋白干扰等因素，传统的免疫组化法(IHC)诊断淀粉样变亚型并不理想。以质谱为基础的蛋白质组学手段，通过鉴定病灶部位的全部蛋白类型，并根据丰度高低判断致淀粉样变蛋白种类，从而实现亚型鉴定已经成为新的诊断方法。在本研究中，我们试图探讨利用激光显微切割联合质谱蛋白质组学(LMD/MS)方法对系统性淀粉样变进行分型的可行性，比较质谱诊断与免疫固定电泳(IFE)、血清游离轻链(FLC)诊断的准确性差异，以及质谱在不同组织类型中分型的成功率。 方法: 应用含有Zwittergent3-16、SDS、PEG20000、尿素的四种蛋白裂解液及FFPE-FASP蛋白提取试剂盒对大鼠脑、心脏、肾脏、肝脏及肺组织FFPE显微切割标本进行蛋白提取，根据鉴定多肽数、蛋白数、谱图数、蛋白丰度确定出最优裂解液并用于淀粉样变质谱分型。 收集北京协和医院2000年1月至2014年5月期间病理确诊为系统性淀粉样变的133例患者的FFPE病理标本。切片行刚果红染色后，利用LMD收集染色阳性区域组织。选取最佳裂解液进行蛋白提取后行质谱分析，根据丰度最高的致淀粉样变蛋白确定淀粉样变亚型。 结果: 在微切标本中，含有Zwittergent3-16的裂解液在鉴定多肽数、蛋白数及蛋白丰度上都具有明显优势，且不对酶切及质谱过程产生干扰，因而将Zwittergent3-16裂解液用于淀粉样变受累组织的蛋白提取。 在拟行淀粉样变分型的133例患者标本中，腹壁脂肪占27％，舌体占20％，齿龈占11％，肾脏占9％，胃肠道占8％，心脏占6％，骨髓及肝脏各占5％，其余类型样本共占9％。116例(87％)获得成功分型，分别为λ轻链型52例(39％)，κ轻链型49例(37％)，ATTR型7例(5％)，AA型2例(2％)，AH/AL+AH型2例(2％)，AFib型2例(2％)，AApoA-Ⅱ型及ALys型各1例(2％)。另有5例患者可排除系统性淀粉样变诊断，8例患者分型失败，4例患者分型不明确。7例ATTR型淀粉样变中，2例基因检测分别为Gly47Arg和Glu54Lys突变，1例患者受累神经免疫组化TTR阳性，其余患者未行基因检测。因此，LMD/MS的总体诊断准确率为91％。在AL型淀粉样变患者中，血清蛋白电泳(SPEP)、IFE和FLC诊断的敏感性分别为23.6％、55.0％及63.9％，特异性分别为92.3％、70.6％及77.8％。而联合IFE及FLC的诊断敏感性为69.4％，特异性55.6％。在LMD/MS分型中，常见受累器官，如心脏、肾脏、肝脏、舌、胃肠道等分型成功率均达到或接近100％。而腹壁脂肪组织的分型成功率仅为86％。 结论: Zwittergent3-16裂解液是提取FFPE微切组织蛋白的最佳裂解液。较之血清学检测及IHC，LMD/MS能更为有效地鉴定出系统性淀粉样变亚型，采用受累器官的活检组织标本可进一步提高分型成功率。

目录

摘要

第一部分： 福尔马林固定石蜡包埋组织标本的蛋白提取方法的优化

引言

1 实验材料

2 实验方法

3 结果

4 讨论

5 结论

第二部分： 系统性淀粉样变的激光显微切割联合质谱蛋白质组学分型

引言

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

5 结论

参考文献

第三部分： 原发性轻链型淀粉样变的治疗进展

附录

致谢

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