链霉菌产生的(4S/R)-4,5-双氢-4-羟基格尔德霉素及其他新次级代谢产物的发现与探索

摘要

链霉菌能够产生结构丰富、活性多样的次级代谢产物，是创新微生物药物的重要来源，因此对链霉菌次级代谢产物进行挖掘和探索对于创新微生物药物研究非常重要。
　　本论文共分为两个部分，其中第一部分为基于细胞色素P450催化机制从Streptomyces hygroscopicus17997中发现和鉴定格尔德霉素新组分，第二部分为链霉菌CPCC203471和CPCC200466产生的抗生素新组分的发现和探索。
　　格尔德霉素(geldanamycin，GDM)是由吸水链霉菌产生的苯醌型安莎类抗生素，为热休克蛋白Hsp90的特异性抑制剂，它的抗肿瘤细胞活性(IC5o)在亚微摩尔级。但GDM的肝毒性强、水溶性差，只能作为抗肿瘤药物开发的先导化合物。目前已报道数百个GDM的有机半合成衍生物，其中多种衍生物具有较好的体内活性，例如17-烯丙氨基-17-去甲氧基格尔德霉素（17-AAG）已针对多种肿瘤进入了Ⅱ期临床试验阶段。此外，许多天然GDM类似物不断从GDM产生菌中被发现和分离出来，它们中某些化合物的水溶性和抗肿瘤细胞活性优于GDM，预示着天然GDM类似物也有成为潜在的抗肿瘤药物可能。
　　GDM的生物合成分为前格尔德霉素形成和PKS后修饰两部分。在PKS后修饰过程中有一个从碳碳单键到双键的氧化脱氢（去饱和）步骤，催化这步反应的酶GdmP属于细胞色素P450超家族。细胞色素P450在生物体内主要催化羟基化反应，仅在极少数情况下催化去饱和反应，因此这步催化反应引起了我们的兴趣:在催化去饱和反应时是否也有羟基化产物出现？依据文献对细胞色素P450催化机制的一般性分析总结，以及我们对GdmP初步的生物信息学分析结果，推测在GdmP催化的C-4,5位去饱和反应过程中也有可能出现羟基化产物。因此，发现该羟基化GDM类似物对于深入理解GDM生物合成具有重要作用，同时，对其抗肿瘤细胞活性进行测定对于获得具有开发前景的GDM衍生物具有实际意义。
　　吸水链霉菌17997（Streptomyces hygroscopicus17997）是中国医学科学院医药生物技术研究所分离鉴定的一株GDM产生菌。根据上面的推测，我们通过TLC和LC-MS/MS等方法对吸水链霉菌17997的次级代谢产物进行了系统分析，发现了两个预期的GDM新组分:化合物1和2。经分离纯化后，采用HRESIMS、IR、NMR及Mosher法等确定化合物1和2为一对差向异构体，化学结构分别为(4S)-4，5-双氢-4-羟基格尔德霉素(1)和(4R)-4，5-双氢-4-羟基格尔德霉素(2)。化合物1和2不能生物转化为GDM，因此它们不是GDM生物合成中的正常中间产物，而是GdmP催化出现的支路产物。化合物1和2的发现使得我们对GdmP在GDM生物合成中催化C-4，5位氧化脱氢的机制有了更加深入的认识。
　　体外抗肿瘤细胞毒性测定表明:与GDM相比，(4S/R)-4，5-双氢-4-羟基格尔德霉素的HepG2肿瘤细胞毒性降低约30倍。说明C-4位羟基化对GDM的活性有不利影响。
　　本论文第二部分对链霉菌CPCC203471和CPCC200466进行了抗菌活性产物鉴定及抗生素新组分发现探索。链霉菌CPCC203471和CPCC200466是经过对20余株不同来源的链霉菌进行次级代谢产物产生情况和活性情况初筛后选定的。这两株菌次级代谢产物较为丰富且活性较好，值得进一步研究。
　　CPCC203471是从滇西森林土壤中分离得到的一株链霉菌，通过TLC、LC-MS以及HRMS等方法对其脂溶性次级代谢产物进行了分析，获得其中的化合物的紫外-可见光吸收光谱、分子量和分子式等信息后，检索天然产物化合物库及SciFinder数据库并查阅文献，对化合物进行排重，首先确定了CPCC203471产生的主要抗菌活性化合物为新生霉素(novobiocin)。随后，从CPCC203471的脂溶性次级代谢产物中发现了6个新生霉素结构类似物，其分子量分别为555(b)、642(d，NOV-642)、555(e)、569(f)、569(g)、598(i)。根据分子量信息，推测化合物b为4

目录

声明

摘要

前言

链霉菌具有丰富的次级代谢产物产生能力

寻找新微生物药物(抗生素)的基本途径及方法

安莎类抗生素

格尔德霉素

香豆素类抗生素

新生霉素

本课题的研究目的及意义

本课题的研究内容及方案

参考文献

第一部分 Streptomyces hygroscopicus 17997产生的(4S／R)-4，5-双氢-4-羟基格尔德霉素的发现——基于细胞色素P450催化机制分析

1 实验材料

1．1 菌株

1．2 格尔德霉素(GDM)

1．3 7-去氨甲酰基-7-羟基-4，5双氢-GDM(CT-1-7)

1．4 主要试剂及材料

1．5 培养基

1．6 主要仪器

2 实验方法

2．1 GDM粗品中各组分的LC-MS／MS分析

2．2 早期鉴别GDM结构类似物的方法-NaOH溶液喷雾显色法

2．3 Streptomyces hygroscopicus 17997的培养和发酵

2．4 化合物的分析检测

2．5 化合物的分离纯化

2．6 化合物的结构解析

2．7 化合物的生物转化

2．8 化合物抗肿瘤细胞活性的初步评价

3．结果与分析

3．1 基于对细胞色素P450催化机制分析的4，5-双氢-4-羟基格尔德霉素的发现

3．2 目标化合物(化合物1和化合物2)的分离纯化

3．3 化合物1和化合物2分别结构解析为(4S／R)-4，5-双氢-4-羟基格尔德霉素

3．4 化合物1和化合物2属于GDM生物合成途径中的支路产物

3．5 化合物1和化合物2有较好的抗肿瘤细胞活性

3．6 4，5-环氧格尔德霉素类似物的发现

3．7 化合物1和化合物2的降解产物分析

4．总结与讨论

第二部分 两株链霉菌的主要活性次级代谢产物鉴定及新组分发现探索

1 链毒菌CPCC 203471产生的新生霉素及其新组分的发现和鉴定

1．1 实验材料

1．2 实验方法

1．3 结果与分析

1．4 总结与讨论

2 链霉菌CPCC 200466产生的噁唑霉素及其新组分的发现和探索

2．1 实验材料

2．2 实验方法

2．3 结果与分析

2．4 总结与讨论

参考文献

全文总结与创新点

细胞色素P450催化的常规与部分非常规反应类型

英文缩略语(Abbreviation)

附录

致谢

个人简历