SIRT2在急性髓系白血病多药耐药中的作用研究

摘要

急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)是血液病中最常见的疾病。目前，药物化疗是治疗AML的主要方法，大部分患者可以经过化疗后得到缓解。但是，部分患者在经过治疗后不能得到完全缓解，另外，完全缓解后的患者中仍有很大部分会复发，最终导致治疗失败。白血病细胞的原发耐药及复发耐药是治疗失败的主要原因。深入探索白血病细胞耐药过程中的分子机制，提高白血病细胞对治疗药物的敏感性是目前研究的热点。SIRT2是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamideadenine dinucleotide，NAD+)依赖性的第三类组蛋白去乙酰化酶Sir2家族成员之一，可通过去乙酰化作用参与细胞分化、细胞内信号转导、细胞迁移、增殖等活动。研究表明SIRT2可参与调节AML细胞的增殖、凋亡和分化活动，但其在AML细胞多药耐药中的作用和机制尚不明确。
　　目的:
　　在原发和复发AML患者细胞中筛查SIRT2是否参与AML对药物的耐受性，并以AML耐药细胞株HL60/A及对药物相对敏感的亲代细胞株HL60为研究对象，研究SIRT2在多药耐药中的生物学作用及其机制。
　　方法:
　　1、对2013年4月～2014年1月中国医学科学院血液病医院收治的25例儿童急性淋巴细胞白血病(children acute lymphoblastic leukemia，children-ALL)患者，20例成人急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)患者，10例原发性血小板增多症(essential thrombocythemia，ET)患者，11例慢性粒细胞白血病(chronic myeloidleukemia，CML)患者，8例真性红细胞增多症(polycythemia vera，PV)患者，11例骨髓增殖性肿瘤(myeloproliferative neoplasm，MPN)患者及15例AML患者骨髓标本进行研究，并收集6例正常供者骨髓标本为对照。分离单个核细胞，应用实时定量PCR方法检测骨髓单个核细胞中SIRT2基因的表达水平;
　　2、对2013年4月～2014年1月本院收治的15例原发AML患者及10例复发AML患者骨髓标本进行研究，分离单个核细胞，应用实时定量PCR方法检测骨髓单个核细胞中SIRT2基因的表达水平;
　　3、应用实时定量PCR方法及Western Blot的方法检测AML耐药细胞株HL60/A及对药物相对敏感的亲代细胞株HL60中的SIRT2的表达水平;
　　4、利用RNA干扰方法，构建靶向SIRT2基因的特异性干扰载体，转染SIRT2高表达的HL60/A细胞株，并采用RT-PCR、免疫荧光和Western Blot方法检测下调后细胞内SIRT2的表达变化，筛选获得SIRT2表达水平下调的细胞（HL60-SIRT2-sh）。采用激光共聚焦显微镜检测阿霉素(doxorubicin，DOX)在细胞内的蓄积，MTT实验检测SIRT2沉默前后HL60/A细胞分别对药物柔红霉素(daunorubicin，DNR)和阿糖胞苷(arabinocytidine，Ara-C)敏感性的变化，利用Hoechst染色、AnnexinⅤ-FITC/PI双染及Western Blot方法检测SIRT2沉默对柔红霉素和阿糖胞苷诱导细胞凋亡能力的影响;
　　5、利用分子克隆技术构建SIRT2的慢病毒表达载体，转染SIRT2低表达的HL60细胞，使其过表达SIRT2，采用RT-PCR、免疫荧光和Western Blot方法检测上调后细胞内SIRT2的表达变化，筛选获得SIRT2表达上调的细胞（HL60-SIRT2）。采用激光共聚焦显微镜检测阿霉素(DOX)在细胞内的蓄积，MTT实验检测过表达SIRT2前后HL60细胞对药物柔红霉素(DNR)和阿糖胞苷(Ara-C)敏感性的变化，利用Hoechst染色、AnnexinⅤ-FITC/PI双染及Western Blot方法检测过表达SIRT2对柔红霉素和阿糖胞苷诱导细胞凋亡能力的影响;
　　6、采用Western Blot方法检测上述干扰、过表达SIRT2基因的细胞中多药耐药相关蛋白(multidrug resistance-associated protein，MRP1)的变化，对ERK1/2、磷酸化ERK1/2表达的影响以及相关蛋白P53和BCL-2的表达变化，进一步采用ERK1/2信号通路抑制剂PD98059研究ERK1/2信号通路在SIRT2参与调控AML多药耐药过程中的作用。
　　结果:
　　1、在多种白血病患者细胞中SIRT2的表达水平均明显高于正常对照组，差异具有统计学意义(P＜0.05);复发AML患者与原发AML患者比较，细胞中SIRT2的表达量增高，差异具有统计学意义(P＜0.05);
　　2、在AML耐药细胞株HL60/A中，SIRT2 mRNA及蛋白表达水平均明显高于其亲代细胞系HL60(P＜0.05);
　　3、成功构建了SIRT2稳定干扰的HL60/A细胞株:HL60-SIRT2-sh1及HL60-SIRT2-sh2;激光共聚焦显微镜检测反射红色荧光的阿霉素(DOX)在细胞内的蓄积，结果显示SIRT2表达下调使得阿霉素在细胞内的蓄积量增加;MTT实验结果显示沉默SIRT2基因后增加了HL60/A细胞对柔红霉素和阿糖胞苷药物的敏感性;凋亡实验结果显示SIRT2基因沉默的HL60/A细胞在柔红霉素、阿糖胞苷药物分别处理后凋亡细胞所占比例均比对照组升高，凋亡效应蛋白caspase-3、caspase-7、caspase-9及caspase-PARP的剪切活化形式均较对照组明显增加，表明SIRT2基因沉默使多药耐药细胞株HL60/A对阿霉素、柔红霉素及阿糖胞苷的敏感性增强;
　　4、成功构建了SIRT2过表达的HL60细胞株(HL60-SIRT2);激光共聚焦显微镜检测阿霉素在细胞内的蓄积，结果显示SIRT2的过表达使得阿霉素在细胞内的蓄积量减少;MTT实验结果显示过表达SIRT2后，HL60细胞对柔红霉素和阿糖胞苷药物的敏感性减弱;凋亡实验结果显示过表达SIRT2的HL60细胞在柔红霉素、阿糖胞苷药物分别处理后凋亡细胞所占比例均较对照组降低，凋亡效应蛋白caspase-3、caspase-7、caspase-9及caspase-PARP的剪切活化形式均较对照组明显减少，表明SIRT2的过表达使HL60细胞对阿霉素、柔红霉素和阿糖胞苷的敏感性降低;
　　5、检测SIRT2基因沉默与过表达细胞中MRP1的表达，结果显示在SIRT2基因沉默的HL60/A细胞中MRP1的表达量降低，而在SIRT2基因过表达的HL60细胞中MRP1的表达量增高，表明SIRT2能够调节MRP1的表达水平;在SIRT2基因沉默的细胞中ERK1/2及其磷酸化水平、P53和BCL-2的表达水平均有变化，其中ERK1/2及其磷酸化水平和BCL-2表达量均降低，P53表达量增高;而在SIRT2基因过表达的细胞中这些蛋白的表达量或磷酸化水平的变化与SIRT2基因沉默细胞中的变化相反;提示在AML细胞中SIRT2表达量的变化能引起ERK1/2相关信号通路活性的改变;
　　6、进一步采用ERK1/2信号通路抑制剂PD98059研究ERK1/2信号通路在SIRT2参与调控AML多药耐药过程中的作用。结果显示，在SIRT2基因沉默的HL60/A细胞或SIRT2基因过表达的HL60细胞中，加入ERK1/2信号通路抑制剂PD98059之后，均能够参与由SIRT2表达量变化所应起的相应改变，提示SIRT2通过调节ERK1/2信号通路的活性影响AML多药耐药。
　　结论:
　　1、在儿童ALL、成人ALL、ET、CML、PV、MPN及AML等血液病患者骨髓中存在SIRT2高表达的现象，AML中复发患者骨髓细胞中SIRT2的表达量高于原发患者。在AML耐药细胞株HL60/A中，SIRT2基因的表达量明显高于对药物敏感的亲代细胞HL60。上述研究结果首次报道SIRT2在多种血液病中的表达情况，提示SIRT2可能参与急性髓系白血病多药耐药的过程。
　　2、SIRT2的表达能够正调控AML细胞对阿霉素、柔红霉素和阿糖胞苷的耐药水平，在SIRT2高表达的HL60/A细胞中下调SIRT2的表达能够减弱HL60/A细胞对柔红霉素等药物的耐药能力，而在SIRT2相对低表达的HL60细胞中过表达SIRT2则能够增加HL60细胞对阿霉素、柔红霉素和阿糖胞苷的耐药能力，以上研究结果证实了SIRT2的表达水平能够调节AML细胞对阿霉素、柔红霉素等药物的耐药能力。此外，研究还揭示ERK1/2信号通路介导了SIRT2在AML细胞多药耐药过程中的调节作用。研究为探索SIRT2在一些血液病发生发展过程中的作用和进一步阐明AML细胞的多药耐药机制奠定了理论基础。

目录

摘要

前言

材料与方法

结果

第一部分 SIRT2在多种血液系统恶性肿瘤患者骨髓标本及细胞系中的表达情况

第二部分 SIRT2干扰载体的构建及稳转细胞系的建立

第三部分 沉默SIRT2基因在HL60／A细胞对药物敏感性中的作用

第四部分 SIRT2过表达载体的构建及稳转细胞系的建立

第五部分 SIRT2基因过表达在HL60细胞对药物敏感性中的作用

第六部分 ERK1／2信号通路在SIRT2介导的AML多药耐药过程中的作用

讨论

参考文献

综述

附录

致谢

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