microRNA-146a调控Toll样受体4信号通路对神经病理性疼痛的影响

摘要

目的：miR-146a是炎性免疫反应的重要调节因子之一，其两个主要靶基因IL-1相关蛋白激酶1(interleukin-1 receptor-associated kinase1，IRAK1)和肿瘤坏死因子受体活化因子6(TNF receptor-associated factor6，TRAF6)是Toll样受体4(toll like receptor4，TLR4)信号转导通路中重要衔接因子，而TLR4信号转导通路的活化与神经病理性疼痛密切相关。本课题拟检测双侧坐骨神经慢性压迫损伤（bilateral chronic constriction injury,bCCI）大鼠L4-6背根神经节(dorsal rootganglion，DRG)中microRNA-146a的表达变化及TLR4信号转导通路活化情况，研究其对IRAK1和TRAF6参与疼痛相关TLR4信号转导通路的调节作用，并探讨干预miR-146a表达后对bCCI神经病理性疼痛大鼠疼痛行为的影响，从而明确m iR-146a对神经病理性疼痛的调控机制。
　　方法：
　　1.检测bCCI神经病理性疼痛大鼠DRG中miR-146a表达及TLR4信号转导通路活化情况雌性SD大鼠，体重200-250g，采用随机数字表法随机分为①正常对照组(Na(i)ve)(N=12);②假手术组(Sham)(N=12):进行大鼠双侧假手术，仅暴露双侧坐骨神经不结扎;③双侧坐骨神经压迫损伤组（bCCI组）(N=12):建立大鼠bCCI模型。在建模前1天、后1、3、7、14及21天监测3组大鼠机械刺激诱发痛、热刺激诱发痛行为学指标。实时定量PCR法检测大鼠L4-6 DRG中TLR4和miR-146a及其靶基因IRAK1、TRAF6的mRNA表达水平;Western-blot法检测TLR4信号转导通路中TLR4、MyD88、TRIF、IRAK1、TRAF6、NF-κB及p-NF-κB蛋白表达水平变化;免疫组化对TLR4、IRAK1和TRAF6定位检测。ELISA检测不同时间点三组大鼠DRG中IL-6和TNF-α的表达水平。
　　2.干预miR-146a表达对bCCI神经病理性疼痛大鼠疼痛行为学影响及其分子机制雌性SD大鼠，体重200-250g，采用随机数字表法随机分为①miR-146a过表达处理组(agomir-146a)(n=6);②miR-146a低表达处理组(antagomir-146a)(n=6);③阴性对照组（negative control，NC）(n=12)。各组均行双侧坐骨神经慢性压迫手术，于手术当天及术后第3、5、7、10天分别经鞘内注射容量为10μl的agomiR-146a或antagomiR-146a及相应对照试剂（5nmol溶于生理盐水），于术前及术后第1、3、7、14天进行动物行为学评估，观察大鼠对机械和热刺激的反应。实时定量PCR法检测术后第14天大鼠L4-6DRGmiR-146a及IRAK1、TRAF6的mRNA表达水平;Western-blot法检测IRAK1、TRAF6蛋白表达水平变化。培养DRG神经元原代细胞，分别孵育agomiR-146a、antagomiR-146a及对照试剂24小时后利用钙成像技术观察各组细胞LPS刺激后细胞内钙离子内流情况。
　　结果：
　　1.与Na(i)ve组及Sham组相比，bCCI组大鼠L4-6 DRG中miR-146a在建模后第3天降低，第7天达最低值，第21天恢复基线水平。IRAK1和TRAF6的mRNA和蛋白水平均明显升高，且3组在不同时间点具有统计学差异(P＜0.05)。免疫组化证实IRAK1和TRAF6均在DRG神经元细胞上表达，且IRAK1以在肽能神经元上表达为主(52.3％)，而TRAF6则较多表达在非肽能神经元上(63％)。
　　2.与Na(i)ve组及Sham组相比，bCCI组大鼠L4-6 DRG中TLR4 mRNA水平显著升高，三组在不同时间点具有统计学差异(P＜0.05)。TLR4、MyD88、NF-κB和p-NF-κB蛋白水平升高(P＜0.05)，TRIF蛋白水平无明显改变(P＞0.05)。免疫组化证实TLR4在DRG神经元细胞上表达;ELISA结果提示相比Na(i)ve组及Sham组，bCCI组大鼠DRG中IL-6和TNF-α表达水平增加(P＜0.05)。
　　3.与NC组相比，agomiR-146a组bCCI大鼠机械刺激阈值和热辐射刺激阈值均升高，各组不同时间点差异具体统计学意义(P＜0.05)。agomiR-146a组bCCI大鼠L4-6 DRG中miR-146a表达量显著上调，IRAK1和TRAF6 mRNA和蛋白水平均显著下降(P＜0.05)。与NC组相比，antagomiR-146a组bCCI大鼠疼痛行为学机械刺激和热刺激阈值无统计学差异。antagomiR-146a组bCCI大鼠L4-6DRG中miR-146a表达下调，IRAK1和TRAF6 mRNA和蛋白水平均显著增加(P＜0.05)。原代DRG神经元细胞钙成像结果显示agomiR-146a可有效减少细胞内钙离子内流阳性率(1.59％)，而antagomiR-146a组细胞内钙离子增加(12.5％)。
　　结论：
　　1.背根神经节中miR-146a表达下调，作用其靶基因IRAK1和TRAF6参与bCCI大鼠神经病理性疼痛。
　　2.bCCI神经病理性疼痛大鼠背根神经节中TLR4-MyD88-NF-κ B信号转导通路活化。
　　3.鞘内注射agomiR-146a上调miR-146a表达水平可有效缓解bCCI神经病理性疼痛大鼠疼痛行为学。

目录

英文缩略词表

摘要

前言

1．背根神经节(dorsal root ganglion，DRG)与神经病理性疼痛

2．TLR4信号转导通路与神经病理性疼痛

3．miRNA与神经病理性疼痛

材料与方法

1．技术路线

2．实验材料

3 实验方法

4 统计学方法

结果

一、bCCI大鼠DRG中miR-146a及其靶基因IRAK1和TRAF6的表达

二、bCCI大鼠DRG中TLR4信号转导通路的表达

三、体内干预miR-146a对bCCI大鼠疼痛行为及靶基因IRAK1和TRAF6的影响

讨论

1．神经病理性疼痛动物模型的选择

2．miR-146a减轻神经病理性疼痛

3．TLR4信号转导通路活化参与神经病理’陛疼痛

4．小结

结论

参考文献

综述一 TLR4与神经病理性疼痛的研究进展

综述二 非编码RNA的作用机制及在神经病理性疼痛中的研究现状

致谢

个人简历

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