青蒿琥酯对烟草烟雾暴露小鼠糖皮质激素敏感性的影响及相关机制研究

摘要

研究目的：
　　第一部分:探究青蒿琥酯对烟草烟雾暴露小鼠肺氧化损伤的影响。
　　第二部分:探究青蒿琥酯对烟草烟雾暴露小鼠气道炎症和糖皮质激素敏感性的影响及可能机制。
　　研究方法：
　　第一部分
　　无特定病原体(SPF)级雌性BALB/c小鼠40只，按随机数字表法平均分为正常组、熏烟组、溶媒组和青蒿琥酯组。后3组小鼠被动吸烟40天(d)，溶媒组和青蒿琥酯组在熏烟前分别腹腔注射溶媒（5％ NaHCO3溶液含5％二甲基亚砜，0.1 ml/只）和青蒿琥酯（30 mg/kg，溶于0.1ml溶媒中），正常组和熏烟组以等量生理盐水作为对照。支气管肺泡灌洗液(BALF)进行细胞分类计数，酶联免疫吸附(ELISA)法测定BALF中白细胞介素(IL)-8、肺组织3-硝基酪氨酸(3-NT)水平;并检测血清丙二醛水平、肺组织总超氧化物歧化酶(SOD)和总谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)活性;观察肺组织病理学改变;Western印迹法测定肺组织核因子E2相关因子2(Nrf2)蛋白表达。
　　第二部分
　　体内实验:SPF级BALB/c小鼠75只，按随机数字表法平均分为正常组、烟雾哮喘组、溶媒组、青蒿琥酯组和地塞米松组。后四组小鼠被动吸烟40天，在第10、17、24天每只小鼠腹腔注射20μg OVA和4mg氢氧化铝凝胶致敏，第31～40天每日雾化吸入1％OVA30分钟(min)激发。正常组小鼠以正常空气代替被动吸烟，以等量的生理盐水代替OVA致敏和激发。在末次激发后，每组随机抽取6只小鼠测定气道反应性，以吸气阻力(RI)、呼吸阻力(RE)和动态肺顺应性(Cydn)作为检测指标。各组余9只小鼠BALF行细胞分类计数，ELISA法检测BALF中IL-4、IL-8、IL-13和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平;HE染色观察肺组织病理学改变;组蛋白去乙酰化酶2(HDAC2)活性检测试剂盒检测肺组织HDAC2活性;Western印迹法测定肺组织PI3Kδ、PI3Kγ、p-Akt1、Akt1、p-HDAC2、HDAC2蛋白表达。
　　体外实验:培养人支气管上皮细胞株BEAS-2B，分为对照组、CSE处理组、地塞米松组、青蒿琥酯地塞米松共同处理组和青蒿琥酯组。CSE孵育后四组细胞6h后，更换培养基，用TNF-α刺激细胞产生IL-8过夜。在TNF-α刺激前，地塞米松组、青蒿琥酯组细胞分别给予地塞米松(10-11～10-6M)、青蒿琥酯(10μM)处理1h，青蒿琥酯地塞米松共同处理组细胞用青蒿琥酯(10μM)联合地塞米松（10-11～10-6M）处理1h。ELISA法检测各组细胞IL-8水平，GraphPad Prism5.0软件计算半抑制浓度(IC50)。HDAC2活性检测试剂盒检测各组细胞HDAC2活性。
　　研究结果：
　　第一部分
　　青蒿琥酯组BALF细胞总数显著低于溶媒组[21.00(2.50)×104/ml比35.50(2.50)×104/ml，P＜0.001]，以中性粒细胞最明显[6.00(5.12)×104/ml比13.60(5.25)×104/ml，P＜0.001]。青蒿琥酯组BALF IL-8、血清丙二醛、肺组织3-NT水平和总SOD活性均显著低于溶媒组[分别为(508±55)比(912±68) pg/ml、(38.2±8.8)比(48.7±10.6)μmol/L、(28.5±5.8)比(50.0±9.7) ng/ml和(11.8±1.8)比(18.0±5.3) U/mg蛋白，均P＜0.05]。4组总GPx活性差异无统计学意义。青蒿琥酯组Nrf2蛋白表达显著高于溶媒组(P=0.008)。
　　第二部分
　　体内实验:1.与正常组相比，烟雾哮喘组小鼠RI、RE显著增高，Cdyn明显降低（均P＜0.001）;青蒿琥酯与地塞米松作用相似，显著降低小鼠对倍增浓度乙酰甲胆碱的气道反应性（均P＜0.001），并改善Cdyn（均P＜0.001）。2.烟雾哮喘组小鼠BALF细胞总数及各分类计数均显著高于正常组（均P＜0.05），尤其中性粒细胞和嗜酸粒细胞显著（均P＜0.05）;与烟雾哮喘组相比，青蒿琥酯和地塞米松均显著降低BALF细胞总数和嗜酸粒细胞数（均P＜0.05），但是青蒿琥酯可以明显降低中性粒细胞数(P＜0.05)，而地塞米松对中性粒细胞数无明显作用。3.与正常组相比，烟雾哮喘组BALF中IL-4、IL-8、IL-13和TNF-α水平均显著升高（均P＜0.001），溶媒对各炎症因子无明显作用;与溶媒组相比，青蒿琥酯明显降低IL-4、IL-8、IL-13和TNF-α水平（分别为P＜0.001，P＜0.001，P＜0.001，P=0.001）;与烟雾哮喘组相比，地塞米松显著降低IL-4、IL-8、IL-13水平（分别为P＜0.001，P=0.017，P＜0.001），但对TNF-α无明显抑制作用(P=0.388)。4.烟雾哮喘组和溶媒组小鼠肺组织切片HE染色与正常组相比有严重的炎症反应，青蒿琥酯和地塞米松可以显著改善肺组织炎症程度。5.烟雾哮喘组肺组织HDAC2活性明显低于正常组(P=0.018)，溶媒对HDAC2活性无明显影响。与溶媒组相比，青蒿琥酯明显恢复HDAC2活性(P=0.030)。地塞米松组HDAC2与烟雾哮喘组相比无显著差异。6.Western印迹结果示各组肺组织PI3Kγ蛋白表达无明显差异;与溶媒组相比，青蒿琥酯明显抑制PI3Kδ蛋白表达(P＜0.001);地塞米松对PI3Kγ和PI3Kδ蛋白表达无明显作用。烟雾哮喘组Akt1磷酸化水平显著高于正常组(P＜0.001);与溶媒组相比，青蒿琥酯明显抑制Akt1磷酸化(P＜0.001);地塞米松对Akt1磷酸化无明显作用。各组HDAC2表达无明显差异。烟雾哮喘组与溶媒组HDAC2磷酸化水平无明显差异，均显著高于正常组(P＜0.001);与溶媒组相比，青蒿琥酯明显抑制HDAC2磷酸化(P＜0.001);地塞米松对HDAC2磷酸化无明显作用。
　　体外实验:对照组地塞米松IC50为6.31×10-9M;地塞米松组IC50为2.51×10-6M，显著高于青蒿琥酯地塞米松共同处理组[（3.98×10-7）M，P＜0.001]。CSE处理组HDAC2活性显著低于对照组(P=0.002);地塞米松组与CSE处理组HDAC2活性无明显差异(P=0.409);青蒿琥酯组和青蒿琥酯地塞米松共同处理组HDAC2活性均显著高于CSE处理组(分别为P=0.001，P=0.009)。
　　研究结论：
　　1.青蒿琥酯减轻烟草烟雾暴露小鼠肺组织氧化损伤并上调Nrf2蛋白的表达，其作用可能通过由Nrf2介导的通路实现。
　　2.青蒿琥酯可能通过抑制PI3Kδ/Akt通路改善烟草烟雾暴露哮喘小鼠气道高反应性和气道炎症，并恢复HDAC2活性。
　　3.青蒿琥酯通过恢复HDAC2活性改善烟草烟雾暴露引起的BEAS-2B细胞激素敏感性降低。

目录

主要缩略语

摘要

第一部分 青蒿琥酯对烟草烟雾暴露小鼠肺氧化损伤的影响

前言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

第二部分 青蒿琥酯对烟草烟雾暴露哮喘小鼠气道炎症和糖皮质激素敏感性的影响

前言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

结论

文献综述 青蒿琥酯在肺部疾病的研究进展

致谢

攻读学位期间发表的论文

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