小鼠植入前胚胎发育及体细胞核移植过程的表观遗传机制研究

摘要

组蛋白修饰对基因的表达起着很重要的调控作用，在植入前胚胎发育过程中，不正常的组蛋白修饰会导致胚胎发育异常甚至胚胎死亡。但是由于技术以及早期胚胎细胞数量的限制，对植入前胚胎全基因组水平上组蛋白修饰的检测至今尚未实现，这极大地阻碍了我们对早期胚胎表观修饰机制的研究。在本论文的第一部分中，我们对最近发表的适用于微量细胞的染色体免疫共沉淀技术进行适当的改进，并利用该技术第一次对小鼠植入前胚胎的组蛋白H3K4me3和H3K27me3修饰进行了全基因组水平上的检测。我们发现在基因的启动子区域，组蛋白H3K4me3修饰的建立更加迅速，而H3K27me3修饰则是在胚胎发育的过程中逐渐建立起来的。并且这两种修饰对DNA序列以及DNA甲基化修饰的偏好性都是明显不同的。非常有趣的是，虽然组蛋白H3K4me3修饰在基因启动子区域的存在是比较稳定的，但是这种修饰的长度却是在不断变化的，而这种长度变化跟基因的表达水平呈现明显的正相关。值得注意的是，我们发现在植入前胚胎中，宽的(broad) H3K4me3修饰的比例要远远高于体外培养的细胞系，而这种宽的H3K4me3修饰无论是在早期胚胎中还是在体外培养的细胞系中都与细胞特异表达的基因有关。另外，在对二价基因的探讨中，我们发现早期胚胎中的二价基因含量更少并且不稳定。通过这些研究，我们第一次建立起了小鼠植入前胚胎发育过程中的组蛋白H3K4me3和H3K27me3修饰图谱，为进一步研究早期胚胎的表观遗传调控机制提供了很好的基础。
　　通过体细胞核移植技术可以将完全分化的体细胞重编程为具有全能性的胚胎。但是到目前为止，体细胞核移植的效率都很低，大部分的核移植胚胎会在发育的早期被阻滞，然而核移植胚胎被阻滞的分子机制还不是很清楚。在本论文的第二部分中，我们建立了基于单细胞测序的核移植胚胎活检技术。通过这种技术我们可以在追踪胚胎发育命运的同时对胚胎的基因表达和DNA甲基化水平进行检测。通过比较不同发育命运的核移植胚胎的基因表达情况，我们找到了一些可能会导致胚胎被阻滞的关键基因，其中过表达组蛋白去甲基化酶Kdm4b，可以修复核移植胚胎组蛋白H3K9me3修饰的缺陷，帮助胚胎克服2-细胞阻滞的障碍。过表达另一个组蛋白去甲基化酶Kdm5b，可以帮助核移植胚胎克服4-细胞阻滞的障碍。同时过表达这两个基因可以使核移植胚胎在组蛋白修饰、DNA甲基化修饰以及基因表达水平上的缺陷得到极大的改善，重要的是过表达这两个基因可以将核移植胚胎的囊胚发育率提高到95％以上，并且对克隆小鼠的出生率也有极大的提高。这些结果说明，通过我们的方法可以有效地识别影响克隆胚胎发育命运的关键因子，同时，我们的研究结果也为进一步了解胚胎发育以及体细胞核移植的分子机制提供了新的视角。

目录

摘要

第一章 前言

1．1 胚胎早期发育

1．1．1 胚胎基因组激活

1．1．2 致密化和细胞分化

1．1．3 胚胎早期发育中的细胞命运决定

1．2 胚胎发育的表观遗传重塑

1．2．1 胚胎发育中的DNA甲基化变化

1．2．2 胚胎发育中组蛋白变体的变化

1．2．3 胚胎发育中组蛋白修饰的变化

1．3 体细胞核移植

1．3．1 细胞的全能性

1．3．2 核移植过程中体细胞核的重编程

1．3．3 核移植胚胎的发育异常

1．3．4 核移植技术的改进

1．4 单细胞测序技术

1．4．1 单细胞RNA测序

1．4．2 单细胞DNA测序

1．4．3 单细胞表观遗传组测序

1．5 课题研究的目的及意义

第二章 实验材料与方法

2．1 实验材料与设备

2．1．1 实验动物

2．1．2 仪器设备

2．1．3 抗体

2．2 早期胚胎的组蛋白修饰检测

2．2．1 胚胎及卵细胞的获取

2．2．2 ULI-NChIP

2．2．3 卵细胞的RNA注射和体外受精

2．3 体细胞核移植

2．3．1 核移植和克隆胚胎培养

2．3．2 核移植胚胎的检测

2．3．3 核移植胚胎活检技术

2．4 单细胞测序

2．4．1 单细胞转录组测序

2．4．2 单细胞甲基化组测序

第三章 实验结果

3．1 植入前胚胎的组蛋白修饰研究

3．1．1 植入前胚胎的组蛋白修饰动态变化图谱

3．1．2 基因的启动子区域H3K4me3和H3K27me3修饰的建立

3．1．3 早期胚胎中H3K4me3信号长度的变化

3．1．4 胚胎发育过程中二价基因的变化情况

3．1．5 小结与讨论

3．2 核移植机制的研究

3．2．1 核移植胚胎的单卵裂球测序

3．2．2 核移植胚胎2-细胞阻滞的关键因子

3．2．3 核移植胚胎4-细胞阻滞的关键因子

3．2．4 Kdm4b和Kdm5b联合注射对核移植效率的影响

3．2．5 小结与讨论

第四章 总结与展望

参考文献

附录

致谢

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