透析法结合超滤法去除冷冻复温红细胞保护剂的方法研究

摘要

为了达到红细胞长期低温保存的目的，需要添加低温保护剂，但在临床使用时，需要将保护剂去除到人体可接受的范围内方可输注。目前临床上去除低温保护剂的常规方法是离心法，并且使用的仪器主要是进口仪器（比如美国全自动红细胞处理仪ACP215型），但是离心过程中的机械应力和管部堆积力会对细胞造成损伤。因此，本研究将在前期课题组基础上应用透析法结合超滤法的原理搭建洗涤体系、优化洗涤方案并对洗涤效果进行研究。
　　目的:为了实现透析法结合超滤法去除冷冻复温红细胞保护剂体系搭建，洗涤条件的优化以及最终对冷冻复温红细胞进行洗涤。本论文将从三个方面进行研究，首先在在前期课题组基础上应用透析法结合超滤法的原理搭建洗涤体系，洗涤过程中，为了简单快速的了解甘油浓度变化情况，研究了渗透压法检测高甘油浓度冰冻红细胞中甘油浓度的可行性;其次因为渗透压的急剧变化会造成红细胞的严重损伤，为了优化洗涤体系的洗涤条件，研究了不同渗透压对人红细胞体积和溶血的影响;最后根据优化的实验方案洗涤冷冻复温的红细胞，对洗涤效果进行研究，并同ACP215的洗涤效果进行比较。
　　方法:洗涤过程中，为了得到渗透压和甘油浓度的相关性，用氯化钠(NaCl)、甘油(C3H8O3)和全血分别制备成不同甘油浓度的盐水溶液以及红细胞溶液，模拟冷冻复温红细胞洗涤过程中的不同状态，用冰点渗透压仪测定其总渗透压值，进行线性回归处理与相关系数的计算，并进行溶血干扰试验及重复性试验;同时为了得到不同渗透压下人红细胞体积和溶血的关系，以梯度浓度的氯化钠溶液提供不同的渗透压环境，加入全血后，离心法测红细胞压积(Hct)，显微镜下记录红细胞形态和直径，并用冰点渗透压仪测定上清的总渗透压，测定上清血红蛋白(Hb)含量，经计算得到不同渗透压下的红细胞体积及溶血率差异;最后通过调整洗涤液流速和血液流速，以优化的实验方案洗涤冷冻复温的红细胞，对洗涤效果进行研究，并同ACP215的洗涤效果进行比较。
　　结果:1、在低渗环境下，当渗透压为148、154、158、171、191和236mOsm/kg时，溶血率分别为（87.3±4.3）％、（79.4±6.7）％、（68.5±6.6）％、(30.2±2.8)％、（6.6±1.0）％和(2.5±0.8)％，红细胞平均体积(MCV)分别为(184.1±32.7)fL、(216.4±62.9)fL、(185.2±27.3)fL、(151.8±6.8)fL、(122.4±3.7)fL和(109.3±2.4)fL;在高渗环境下，当渗透压为810、1073、2460和3033mOsm/kg时，溶血率分别为（2.1±0.7）％、(2.5±0.6)％、（25.2±8.7）％和（55.8±13.8）％，MCV分别为(58.1±1.9)fL，(60.6±2.8)fL、(74.5±4.8)fL和(80.1±13.9)fL;在等渗环境，溶血率为（1.9±0.8）％，MCV为(94.9±1.08)fL。储存一周的血液和储存五周的血液总体的变化趋势相同，只是变化程度略有差异。
　　2、当溶液中仅存在甘油和NaCl两种成分时，甘油浓度与总渗透压之间有良好的线性关系， R2=0.9965。回收率在90％-110％之间。重复性和稳定性的变异系数小于1％。测定不同甘油浓度的血液样本时发现，甘油浓度与总渗透压间的线性关系良好，y=15.253x+219.93，R2=0.9981，回收率较高。重复性的变异系数小于2％。干扰实验结果表明在游离血红蛋白为(1.71～15.16) g/L时，总渗透压值相差不大。血液混悬液的总渗透压值与其上清液的总渗透压值结果一致，经Wilcoxon符号秩检验分析p=0.156，差异无统计学意义。
　　3、洗涤液和血液流速增加后，渗透压随时间变化的曲线斜率增大，溶液渗透压能更快的下降，洗涤效率更佳。冰冻复温红细胞洗涤后发现透析法结合超滤法去除冷冻复温的冰冻红细胞保护剂之后，其中红细胞计数回收率为(92.33±5.87)％、血液渗透压为(291±1.77)Osm/kg，上清游离血红蛋白为(0.74±0.13)g/L，甘油浓度为（0.24±0.12）g/L，均可达到国家标准。并且同ACP215的方法比较发现，红细胞计数回收率、甘油浓度、上清游离血红蛋白均有统计学差异，透析法结合超滤法在甘油浓度和红细胞计数回收率上优于ACP215，但是上清游离血红蛋白含量高于ACP215。
　　结论:1、渗透压从低渗到高渗变化过程中，红细胞的体积逐渐减小，溶血率先降低后升高，为了使细胞回收率＞80％，红细胞的体积变化需小于1.5倍原体积，大于0.68倍原体积。为了使细胞回收率＞90％，红细胞体积变化需小于1.4倍原体积，大于0.68倍原体积。
　　2、在甘油浓度较高的情况下，可以采用测定其总渗透压的方式了解甘油浓度，这种方法简单，快捷，样本用量少，试剂消耗少，少量的血红蛋白对其干扰作用较小。
　　3、在前期课题组基础上应用透析法结合超滤法的原理搭建洗涤体系，并对洗涤液和血液流速优化调整后，透析法结合超滤法是一种可行的洗涤方式，在甘油浓度和红细胞计数回收率上优于ACP215，但是上清游离血红蛋白含量高于ACP215。

目录

摘要

引言

第一部分 不同渗透压对人红细胞体积和溶血的影响

背景

1．实验器材

2．实验步骤

2．1 氯化钠溶液的配制

2．2 红细胞的处理

2．3 氯化钠溶液的添加

2．4 相关指标的测定

2．5 统计学分析

3．结果

3．1 梯度浓度NaCl溶液与其初始渗透压及红细胞上清渗透压的相关性

3．2 不同盐水浓度下的红细胞压积和溶血情况

3．3 梯度盐水溶液中红细胞的体积

3．4 显微镜下计量细胞直径

4、讨论和结论

参考文献

第二部分 渗透压法检测冰冻红细胞甘油浓度的研究

背景

1 实验器材

2、实验步骤

2．1 替代血液甘油浓度同渗透压的关系的实验步骤

2．2 不同甘油浓度的红细胞悬液同渗透压的关系的实验步骤

3、结果和分析

3．1 替代血液甘油浓度同渗透压的关系的结果分析

3．2．不同甘油浓度的红细胞悬液同渗透压的关系的结果和分析

4 讨论

参考文献

第三部分 超滤法结合透析法去除深低温红细胞保护剂

背景

1、实验材料

2、实验过程和方法

2．1 替代血液摸索实验体系的实验条件的实验过程和方法

2．2 冰冻-复温后的红细胞的洗涤效果研究的实验过程和方法

3、实验结果和分析

3．1 替代血液摸索实验体系的实验条件的实验结果和分析

3．2 冰冻-复温后的红细胞的洗涤效果研究的实验结果

4、讨论和结论

5、展望

参考文献

综述 红细胞低温保存保护剂去除技术的研究进展

已发表的文章

致谢

声明