新型抗结核先导物的筛选发现与分子药理学研究

摘要

结核病是由结核分枝杆菌引起的严重危害人类健康的传染性疾病。全世界约有三分之一的人感染结核分枝杆菌。在2014年结核病导致约150万人死亡。虽然近两年有新的抗结核药物上市，但已有耐药菌株出现的报道。因此仍然急需开发新机制的高效低毒的抗结核药物。
　　氨酰-tRNA合成酶(AaRS)能够将氨基酸和对应的tRNA合成氨酰-tRNA(aa-tRNA)，在蛋白质生物合成中起着至关重要的作用。酪氨酰-tRNA合成酶（TyrRS）是该家族中的一员，阻断其功能就能抑制病原菌的生长繁殖。结核中的TyrRS蛋白与人体内的同源蛋白结构差异巨大，因此针对该靶点可能发现新的低毒高效的抗结核化合物。
　　本研究中我们利用大肠杆菌原核表达系统，在体外表达纯化了具有良好催化活性的结核TyrRS蛋白。在此基础上，利用同位素方法建立了酶抑制剂筛选模型。同时使用结核分枝杆菌的近缘菌株耻垢分枝杆菌作为检定菌建立了表型筛选体系。联用两种方法对本实验室保存的10万个化合物进行了筛选，最终发现了一个同时具有酶抑制活性和抗结核活性的化合物IMB-T130。测定了该化合物对结核分枝杆菌的抑制活性，发现它对结核标准菌株H37Rv具有良好的抑制作用，MIC为0.08μg/mL。特别的是它对临床分离的耐药菌株表现出良好的抑制活性，强于一线抗结核药物异烟肼和利福平。我们通过表面等离子共振(SPR)实验在分子水平证明了化合物和TyrRS蛋白之间存在相互作用。进一步构建了TyrRS蛋白过表达的耻垢分枝杆菌菌株，发现对化合物敏感性降低，在细胞水平验证了化合物的靶向抑制作用。通过计算机软件进行分子对接，我们分析了化合物与蛋白的相互作用机制。进一步对化合物细胞毒性，急性毒性和药代动力学性质进行了检测，结果显示化合物毒性较小，具有良好成药性。测定了化合物对于一系列革兰氏阳性、阴性菌株的抗菌谱，结果显示化合物对于结核分枝杆菌具有良好的选择性。
　　考虑到化合物对TyrRS酶抑制活性和体外抗菌活性之间存在一定差异，我们推测该化合物可能还作用于其他重要的抗结核靶标。收集整理了已报道的结核分枝杆菌关键蛋白结构，通过计算机软件与IMB-T130进行分子对接，分析对接模型以寻找化合物新的作用靶标，我们推测莽草酸途径中的3-脱氢奎尼酸合酶(DHQS)可能是IMB-T130发挥抗菌作用的另一靶标。以此为基础，我们在体外表达纯化了结核DHQS蛋白，通过孔雀绿定磷法检测催化反应中生成的游离磷酸，建立了酶活性测定体系，在酶水平验证IMB-T130对该蛋白具有更强的抑制作用。SPR实验结果进一步证明了化合物和DHQS蛋白之间存在相互作用。通过高效液相技术对反应底物测定，同样证明阳性化合物确实阻断了催化反应的发生。以上实验结果初步证实DHQS蛋白可能是化合物IMB-T130抗结核机制中更为关键的靶标蛋白。
　　本研究首次报道了化合物IMB-T130的抗结核分枝杆菌活性，它是第一个能够有效抑制结核DHQS蛋白活性且同时具有优秀抗结核作用的化合物。该化合物具有新的靶点与作用机制，与现有抗结核药物不存在交叉耐药，有可能发展成为新型抗结核先导化合物。

目录

摘要

缩略语表

前言

实验材料

实验方法

1．结核分枝杆菌TyrRS基因的获得

2．重组克隆质粒的构建以及验证

3．重组表达质粒的构建及验证

4．TyrRS蛋白的诱导表达

5．蛋白的诱导表达条件的优化

6．目的蛋白纯化

7．TyrRS酶活性测定

8．耻垢分枝杆菌筛选模型建立

9．酶筛选模型建立

10．化合物的体外抗结核活性测定

11．表面等离子共振实验

12．过表达菌株敏感性变化验证化合物作用靶标

13．利用Discovery Studio 4．0TM软件进行分子对接

14．MTT方法检测阳性化合物对真核细胞毒性的影响

15．化合物IMB-T130对一系列细菌抑制作用的测定

16．IMB-T130的急性毒性实验

17．IMB-T130的药代动力学实验

18．IMB-T130反向找靶

19．结核分枝杆菌DHQS蛋白表达

20．DHQS蛋白测活体系的建立

21．IMB-T130对DHQS的抑制作用的测定

22．高效液相色谱检测酶反应底物变化

23．表面等离子共振实验证明IMB-T130与DHQS的结合

实验结果

1．结核分枝杆菌TyrRS基因PCR结果

2．重组克隆质粒构建与验证

3．重组表达质粒的构建及验证

4．TyrRS蛋白表达条件的优化

5．TyrRS蛋白纯化

6．酶活测定方法

7．耻垢分枝杆菌筛选

8．酶水平筛选模型条件优化

9．IMB-T130的抗结核活性测定

10．表面等离子共振实验

11．过表达菌株敏感性变化结果

12．Discovery Studio 4．0TM软件系统进行分子对接结果

13．化合物IMB-T130对人细胞毒性测定结果

14．化合物IMB-T130对一系列细菌MIC的测定

15．化合物IMB-T130的急性毒性和药代动力学实验结果

16．化合物IMB-T130的反向找靶

17．结核分枝杆菌DHQS蛋白表达

18．DHQS蛋白活性测定体系建立

19．化合物IMB-T130对DHQS蛋白活性的抑制作用

20．高效液相检测底物DAHP量的变化

21．SPR实验检测化合物IMB-T130与DHQS蛋白的相互作用

讨论

结论

创新点

参考文献

文献综述 以莽草酸激酶作为抗结核分枝杆菌靶点的研究进展

发表文章及参加会议

致谢

附录

声明