肥胖与体重正常女性皮下脂肪组织差异microRNA的分析

摘要

目的:肥胖发病率日益升高，给全社会带来沉重的医疗负担。microRNA（miRNA）是一组保守的非编码小RNA，可以在转录后水平对靶基因发挥负性调控作用。本文旨在研究肥胖、正常体重女性皮下脂肪组织miRNA的表达差异，探究miRNA调节肥胖发生发展的机制。
　　方法:纳入3名肥胖女性和5名体重正常女性，中位年龄分别为40(30-56)岁和49(37-51)岁，完善临床资料、生化指标测定。取腹部皮下脂肪组织，抽提包含miRNA在内的总RNA，与Affymetrix miRNA4.0芯片杂交，并进行差异miRNA的筛选和聚类分析。利用软件miRanda和Targetscan预测差异miRNA的靶基因，利用GO数据库和KEGG数据库对靶基因进行显著性功能分析和显著性信号通路分析。将所纳入的样本扩增为8名肥胖女性和9名体重正常女性，平均年龄分别为34.88±9.67岁和42.11±6.68岁，采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法对部分差异miRNA进行验证，并在信使RNA(mRNA)的层面检测部分靶基因在两组间的表达。
　　结果:肥胖女性体质指数(BMI)、体重、腰围显著高于体重正常对照(P＜0.05)。皮下脂肪组织miRNA芯片提示:与体重正常女性相比，肥胖女性皮下脂肪组织中共有58种miRNA出现了4倍以上的差异表达，其中，54种miRNA表达下调，4种miRNA表达上调（倍数＞4，P＜0.01，FDR＜0.05）。针对差异miRNA，采用两种不同的靶基因预测软件——miRanda和Targetscan预测出交集靶基因1333个。这些靶基因使269个功能和89条信号通路发生了显著性改变(P＜0.001，FDR＜0.05)。其中，显著性改变程度较高的生物学功能包括:DNA的转录及其调控，细胞粘附，小分子物质代谢等。显著性改变程度较高的信号通路包括:MAPK通路、癌症相关通路、PI3K-Akt通路等。进一步，采用qRT-PCR的方法证实miR-143-3p，miR-143-5p，miR-145-5p和let-7a-5p在肥胖女性皮下脂肪组织中显著下调，表达量分别为体重正常对照的68％(P=0.046)、61％(P=0.016)、73％(P=0.042)、66％(P=0.006)，与miRNA基因芯片的检测结果一致。更进一步，对上述差异miRNA预测所得的靶基因，包括高迁移率族蛋白A2(HMGA2)，Thy1细胞表面抗原(THY1)、Tar DNA结合蛋白(TARDBP)、衔接因子蛋白含pH域磷酸酪氨酸结合域和亮氨酸拉链基元1(APPL1)、脂肪酸转运蛋白-1(FATP1)、葡萄糖磷酸变位酶3(PGM3)的mRNA水平进行了研究，结果发现let-7a-5p调控的靶基因HMGA2在肥胖女性皮下脂肪组织中表达明显增加，是体重正常女性的3.19倍(P=0.025)。
　　结论:肥胖女性的皮下脂肪组织中58种miRNA出现了4倍以上的差异表达，其中，93％(54/58)的差异miRNA表达下调，7％(4/58)的差异miRNA表达上调，这些差异miRNA预测调节的靶基因主要参与DNA的转录及其调控等生物学功能和MAPK等信号通路。qRT-PCR的方法证实4种差异miRNA:miR-143-3p，miR-143-5p，miR-145-5p，let-7a-5p在肥胖女性皮下脂肪组织中显著下调，let-7a-5p的靶基因HMGA2在肥胖女性皮下脂肪组织表达明显增加，它们可作为肥胖患者脂肪组织的生物标记和潜在的减肥治疗靶点。

目录

摘要

英文缩略词表

前言

实验材料

5．标本来源

2．入选标准

3．标本的采集和处理

4．主要仪器设备

5．主要试剂与耗材

6．溶液配制

实验方法

1．实验方案

2．实验流程图

3．总RNA提取

4．RNA检测

5．miRNA芯片杂交

6．miRNA靶基因预测

7．显著性功能和通路分析

8．miRNA的逆转录

9．miRNA引物合成

10．miRNA的qRT-PCR反应(SYBR法)

11．mRNA的逆转录

12．mRNA引物合成

13．miRNA的qRT-PCR反应(SYBR法)

14．qRT-PCR的分析方法

15．统计分析

结果

一．miRNA芯片检测

二．肥胖和体重正常女性皮下脂肪组织差异miRNA的生物信息学分析

三．肥胖和体重正常女性皮下脂肪组织差异miRNA的验证

讨论

结论

参考文献

脂肪分布与MicroRNA

致谢

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