基于BMMNCs的骨再生策略在骨缺损修复中的动物实验与临床研究

摘要

目的:
　　骨缺损的修复是临床治疗的巨大挑战，传统的自体骨移植因来源有限和供区损伤等问题具有很大的局限性。组织工程骨的发展为骨缺损治疗开辟了崭新的途径。然而，体外培养组织工程骨过程复杂且成本高昂，已经开展的临床试验数量很少，因此，组织工程骨尚不能常规进入临床使用。由于骨髓血中富含骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)，新鲜采集的骨髓血常被用于辅助骨缺损的修复，通过将骨髓血中的骨髓单个核细胞(bone marrow mononuclear cells，BMMNCs)浓缩富集，可提高干细胞的浓度。近年来，已经有许多直接运用浓缩骨髓进行骨缺损修复的临床报道，并且开始逐渐推广。这种方法与经典的组织工程骨相比，二者修复效果有何差别尚无相关报道，特别是缺乏详细的大动物实验研究。为此，在大动物体内构建节段性骨缺损模型，以β-磷酸三钙(tricalcium phosphate，TCP)为支架，比较运用BMMNCs和经体外培养扩增的BMSCs修复骨缺损的差异，并进行了长达一年的观察。用多种先进的技术手段对两种方法形成的再生骨组织进行了形态、化学构成及生物力学的研究和比较，并找到了再生骨组织与自体正常骨组织之间的差异。此外，首次使用BMMNCs复合β-TCP修复临床齿槽裂骨缺损，并通过三维CT与传统的自体骨移植进行了为期一年的随访比较，为BMMNCs进一步的临床应用打下了重要的基础。
　　方法:
　　1.制备BMMNCs/β-TCP和BMSCs/β-TCP两种移植物:从比格犬髂后上嵴抽取骨髓血15ml，以Ficoll密度梯度离心法制备BMMNCs，将其体积浓缩为500μl，然后接种至加工好的圆柱形β-TCP支架上。用瑞氏-姬姆萨染色观察处理前后骨髓血成分的变化，同时以犬细胞因子芯片测量BMMNCs中常见细胞因子的含量，并与外周血、未浓缩骨髓血作比较。同样方法抽取15ml骨髓血，从中分离培养BMSCs，扩增至P1代时，调整细胞浓度为20×106/ml，体积500μl，接种至相同支架上，换用成骨诱导培养基，继续培养14天。以CM-Dil染料染色后在共聚焦显微镜下观察两种移植物细胞分布情况。
　　2.比格犬胫骨节段性骨缺损的修复:建立比格犬胫骨节段性骨缺损模型，应用制备好的BMMNCs/β-TCP移植物、BMSCs/β-TCP移植物进行修复，以单纯β-TCP支架和空白处理作为对照。术后2周，3月，6月，12月分别行X线观察，术后12月行SPECT-CT检查，12月取材后通过大体观察，Micro-CT，硬组织切片组织学检查评价修复效果。
　　3.再生骨组织的微观结构、化学组成与生物力学分析:以BMMNCs/β-TCP和BMSCs/β-TCP两种典型的方法修复比格犬胫骨节段性骨缺损，术后12月取材，同时取对侧自体骨为对照，样本包埋并打磨后，以双光子和二次谐波显微显像的方法检测骨组织的胶原和血管等细微结构，以激光拉曼光谱检测骨组织化学成分，以纳米压痕仪检测骨组织微观力学性能。
　　4.BMMNCs复合β-TCP修复临床齿槽裂:首先定量分析齿槽裂缺损的体积，采用三维打印和计算机辅助法计算骨缺损区域体积，以明确所需移植物量;然后分别以BMMNCs复合β-TCP和自体髂骨移植物进行骨缺损修复。术后3月，6月，12月进行三维CT影像学分析，评估缺损修复情况和移植物变化。
　　结果:
　　1.从比格犬15ml骨髓血中平均获取BMMNCs浓度为33.0±8.8×106/ml，浓缩后可见其成分主要为有核细胞，而红细胞含量大幅下降，细胞在β-TCP支架上均匀散在分布，镜下呈圆形。细胞因子分析显示，IL-8在BMMNCs中明显高于外周血和未浓缩的骨髓血，而BMMNCs和骨髓血中晚期糖基化终产物受体(the receptor of advanced glycation end products，RAGE)和干细胞因子(stem cell factor，SCF)的浓度则较外周血低。15ml骨髓血经培养扩增后获得BMSCs细胞浓度为20×106/ml，体外成骨诱导成功，细胞在支架上交织成网状紧密黏附。
　　2.比格犬胫骨节段性缺损修复实验中，BMMNCs组表现出更好的修复效果，该组80％的动物均在术后3月即形成了明显的骨连接，取出内固定后无再骨折发生;术后12月可见骨痂改建，骨皮质密度增加，髓腔形成，移植物与自体骨组织衔接良好，无明显分界。在BMSCs组中，术后3月与6月截骨线仍明显，无法及时拆除内固定，移植物与自体胫骨分界清晰，大量支架未能降解，支架周围骨质菲薄，但支架内部可见较多的骨组织形成。单纯支架组的移植物术后6月几乎完全吸收。SPECT-CT示BMMNCs组移植物区域较BMSCs组有更明显的放射性浓聚，表明其代谢活跃。Micro-CT分析BMMNCs组平均骨组织体积为1231.38mm3，骨组织占比65.14％。BMSCs组平均骨组织体积为755.65mm3，骨组织占比41.29％，二者差异具有显著性。
　　3.双光子和二次谐波信号显示BMMNCs组样本的胶原纤维贴附于孔壁，呈层状排列，或在孔中央呈同心圆样排列形成类哈弗斯管结构，骨细胞位于胶原层之间，血管位于胶原中央或贴附于材料孔壁上。在BMSCs组样本中，可见胶原纤维呈束状由孔壁或联通孔处发散，密度较BMMNCs组低，同心圆结构不明显。拉曼光谱检测显示BMMNCs组样本、BMSCs组样本和自体胫骨组织的峰位相似，但强度不同。BMNNCs组的矿物/基质比显著高于BMSCs组;碳酸/磷酸比在自体骨组织中较再生骨组织低;胶原交联比在BMMNCs组样本中较自体骨低，但在BMSCs组则与自体骨无显著差异;碳酸/氨基酸Ⅰ比值在BMMNCs组中显著升高，可见该组样本中存在很活跃的骨改建活动。纳米压痕结果显示BMMNCs组样本的压痕模量为15.61Gpa，硬度为0.67Gpa，与自体骨组织相似，并显著高于BMSCs组。
　　4.术前齿槽裂患者的骨缺损体积在3D打印模型上计算所得平均值为1.52ml，略高于通过计算机辅助工程(computer aided engineering，CAE)软件计算的体积(1.47ml)，二者无显著差异，两种方法均适用于齿槽裂的术前评估。在齿槽裂修复研究中，所有的患者术区均愈合良好，没有严重并发症出现。BMMNCs组多数患者(8/10)的齿槽裂得到了较好的修复，形成了骨连接。术后3月，BMMNCs组移植物的平均体积为7245±220.5mm3。术后六月，移植物体积降低至6122±211.5mm3。术后12月平均BV与术后六月相似，为5890±180.5mm3。自体髂骨组与BMMNCs组相似，术后6月移植物平均体积为678.7±2110mm3与BMMNCs组相似，术后12月移植物平均体积与6月时相似，为635.3±1975mm3。两种方法相比无显著差异。
　　结论:
　　1.在比格犬胫骨节段性缺损的修复中，采用直接浓缩制备的BMMNCs结合β-TCP材料比采用经体外培养并成骨诱导后的BMSCs效果更好。
　　2.与BMSCs相比，BMMNCs结合β-TCP策略形成的骨组织更加丰富，其化学成分、生物力学性质也与自体骨组织更加接近。
　　3.在齿槽裂修复中，缺损体积在术前通过3D打印模型和CAE软件计算均能较准确地获取，术者可通过每个患者的具体情况灵活选择适合的体积评估方法。
　　4.BMMNCs复合β-TCP颗粒在修复齿槽裂缺损中的效果与自体髂骨移植相当，但该方法与自体髂骨移植一样，在术后6月内会出现明显的移植物吸收。

目录

英文缩略词表

摘要

引言

第一章 BMMNCs与BMSCs移植物在大动物节段性骨缺损修复中的比较研究

第一节 BMMNCs与BMSCs复合β-TCP移植物的体外制备

第二节 BMMNCs与BMSCs移植物修复比格犬胫骨节段性缺损

第三节 再生骨组织的微观结构、化学构成与生物力学分析

第二章 BMMNCs在齿槽裂修复中的临床研究

第一节 齿槽裂骨缺损体积的术前评估

第二节 BMMNCs复合β-TCP修复齿槽裂的临床对照研究

全文总结

参考文献

综述 细胞治疗在临床骨损伤修复中的应用进展

致谢

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