电针百会、足三里穴对脑缺血再灌注大鼠内质网应激通路影响的研究

摘要

目的：
　　脑缺血再灌注损伤病理机制十分复杂，细胞凋亡是缺血性脑损伤重要原因之一。线粒体途径、死亡受体途径和内质网途径是调节细胞凋亡的三条主要途径。近年来内质网应激凋亡通路在脑缺血再灌注损伤中的作用成为研究热点。本研究采用线栓法制作火鼠大脑中动脉闭塞脑缺血再灌注模型，探讨电针百会、足三里穴对脑缺血再灌注损伤大鼠的保护作用，并探讨其作用机制是否与内质网应激介导的细胞凋亡有关，为临床治疗脑血管病提供实验依据。
　　方法：
　　随机数字表法将63只健康雄性SD大鼠随机分为假手术组、模型组和电针组，每组根据再灌注时间进一步分为24h和72h亚组。利用线栓法建立右侧大脑中动脉栓塞再灌注损伤模型，并分别在规定时间点取材。假手术组仅分离右侧颈总、颈内和颈外动脉，不插入线栓，模型组制作脑缺血再灌注模型，假手术组和模型组大鼠每日接受同电针组一样的抓取束缚刺激。电针组造模成功后取百会、左足三里穴电针干预20min/日。
　　在规定时间点评估大鼠的神经功能缺损程度;以TTC法评估大鼠脑梗死体积;Tunel法检测脑组织细胞凋亡情况;免疫荧光染色观察NeuN及GFAP表达;免疫组织化学染色和免疫印迹法(Western blot)检测脑缺血大鼠葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、C/EBP同源蛋白(CHOP)、磷酸化的真核细胞翻译起始复合物2α(p-eIF2α)、Caspase12、Bcl-2/Bax蛋白的表达;采用实时荧光定量PCR法检测脑缺血大鼠GRP78、CHOP、p-eIF2α、Caspase12、Bcl-2/Bax mRNA的表达。
　　结果：
　　1.神经功能缺损情况:三组大鼠在造模前行为学表现一致，Longa评分为0分，且均能在10s之内将前肢的粘附物移除。再灌注24h和72h，模型组、电针组大鼠Longa评分和粘附移除时间显著高于假手术组(P＜0.05)，造模后大鼠的感觉和运动均有下降;电针组大鼠在24h和72h的Longa评分均显著低于模型组（P＜0.05）;再灌注24h，电针组大鼠的粘附移除时间与模型组无明显差异，再灌注72h，电针组大鼠粘附移除时间明显较模型组缩短（P＜0.05）。
　　2.脑梗死情况:再灌注72h，假手术组大鼠各个脑片均为红色，未见脑梗死区;模型组和电针组大鼠均存在不同程度白色梗死区，主要分布于视交叉前后的大脑中动脉供血区，与动脉栓塞的位置一致;电针组大鼠的脑梗死体积显著低于模型组(P＜0.05)。
　　3.TUNEL染色显示:再灌注72h，模型组和电针组大鼠细胞凋亡显著高于假手术组(P＜0.05);电针组细胞凋亡显著低于模型组(P＜0.05)。
　　4.免疫荧光染色显示:再灌注72h，模型组和电针组大鼠的NeuN阳性细胞数量显著低于假手术组(P＜0.05);与模型组相比，电针组大鼠的NeuN阳性细胞数量显著升高(P＜0.05);GFAP的结果与NeuN免疫荧光结果相反，再灌注72h，假手术组的GFAP阳性细胞体积小、突触少，荧光强度较弱，提示星形胶质细胞处于静息状态，模型组和电针组大鼠的GFAP阳性细胞体积大、突触多，荧光强度强，星形胶质细胞处于活化状态;电针组大鼠的GFAP平均荧光强度显著低于模型组(P＜0.05)。
　　5.内质网应激相关指标:
　　(1)GRP78:①免疫组化:GRP78蛋白主要在胞浆表达，假手术组GRP78蛋白呈低表达，且显著低于同一时间点的模型组和电针组(P＜0.05);电针组与同一时间点的模型组相比，GRP78蛋白表达显著升高，差异具有统计学意义(P＜0.05)。②Western blot:模型组GRP78蛋白表达显著高于同一时间点的假手术组(P＜0.05)，电针组各个时间点GRP78蛋白表达与模型组相比无统计学差异。(P＞0.05)。③qPCR:模型组和电针组GRP78mRNA表达显著高于同一时间点的假手术组;电针组GRP78mRNA表达均高于同一时间点的模型组（P＜0.05）。
　　(2)CHOP:①免疫组化:CHOP蛋白在胞浆和胞核均有表达，假手术组大鼠CHOP蛋白呈低表达，再灌注24h，模型组CHOP蛋白表达与电针组无统计学差异;再灌注72h，电针组CHOP蛋白显著低于模型组(P＜0.05)。②Western blot:再灌注24h和72h，模型组和电针组CHOP蛋白表达显著高于假手术组(P＜0.05);电针组与同一时间点的模型组相比，CHOP蛋白显著降低（P＜0.05）。③qPCR:同一时间点的模型组和电针组CHOP mRNA的表达显著高于假手术组(P＜0.05);再灌注24h、72h，电针组CHOP mRNA的表达显著低于模型组(P＜0.05)。
　　(3)p-eIF2α:①免疫组化:假手术组p-eIF2α蛋白呈低表达，再灌注24h及72h，模型组和电针组p-eIF2α蛋白表达显著升高(P＜0.05);再灌注24h，模型组和电针组p-eIF2α蛋白表达无显著性差异;再灌注72h，电针组p-eIF2α蛋白表达显著低于模型组(P＜0.05)。②Western blot:模型组和电针组p-eIF2α蛋白表达显著高于假手术组;电针组与同一时间点的模型组相比，p-eIF2α蛋白表达水平显著降低(P＜0.05)。③qPCR:假手术组p-eIF2αmRNA呈低表达，与假手术组相比，模型组和电针组p-eIF2αmRNA表达显著升高(P＜0.05);电针组p-eIF2αmRNA表达显著低于与同一时间点的模型组(P＜0.05)。
　　(4)Caspase12:①免疫组化:Caspase12胞浆胞核均有表达，但以胞浆表达为主，与假手术组相比，模型组和电针组Caspase12蛋白表达均显著增高(P＜0.05);再灌注24h，电针组与模型组Caspase12蛋白表达无统计学差异，再灌注72h，电针组Caspase12蛋白表达显著低于模型组(P＜0.05)。②Western blot:假手术组Caspase12蛋白呈低表达，模型组和电针组Caspase12蛋白表达均显著增高(P＜0.05);电针组与模型组相比，各个时间点Caspase12蛋白表达均显著降低(P＜0.05)。③qPCR:Caspase12mRNA表达与Western blotting法结果趋势一致;电针组与同一时间点的模型组相比，Caspase12mRNA表达显著降低，差异具有显著性(P＜0.05)。
　　(5)Bcl-2/Bax:①免疫组化:模型组大鼠Bcl-2蛋白表达显著低于假手术组(P＜0.05)，Bax蛋白表达显著高于假手术组(P＜0.05);与同一时间点的模型组相比，电针组Bcl-2蛋白表达显著升高;再灌注24h，模型组和电针组Bax蛋白表达无显著性差异，再灌注72h，电针组Bax蛋白表达显著低于模型组(P＜0.05)。②Western blot:模型组大鼠Bcl-2蛋白表达显著低于假手术组（P＜0.05），且在72h表达低于24h;模型组Bax蛋白表达显著高于假手术组(P＜0.05)，且在72h表达高于24h。电针组与模型组相比，Bcl-2蛋白表达显著升高，Bax蛋白表达显著降低(P＜0.05)。③qPCR:Bcl-2及Bax mRNA表达趋势同Western blot;电针组与同一时间点的模型组相比，Bcl-2mRNA表达显著升高（P＜0.05），Bax mRNA表达显著降低(P＜0.05)。
　　结论：
　　1.电针百会、足三里穴能改善脑缺血再灌注72h大鼠的神经功能缺损和脑梗死体积，并能降低细胞凋亡比例，对缺血脑组织具有一定的保护作用。
　　2.电针百会、足三里穴可促进脑缺血再灌注72h大鼠NeuN表达上调，GFAP表达下调，具有保护缺血半暗带神经元，减轻神经元丢失，抑制星型胶质细胞增生活化的作用。
　　3.大鼠脑缺血2h再灌注损伤24h及72h，内质网应激相关分子GRP78、p-eIF2α、CHOP、Caspase12的蛋白及mRNA表达增加，缺血再灌注损伤诱发了内质网应激，电针百会、足三里穴可通过UPR促进内质网功能恢复;上调脑缺血大鼠抑制凋亡基因Bcl-2表达，下调内质网应激通路中p-eIF2α、CHOP、Caspase12蛋白及mRNA的表达，减少凋亡基因Bax表达，改善内质网应激，减轻脑缺血再灌注损伤。
　　4.内质网应激凋亡途径在脑缺血再灌注损伤病理机制中有重要作用，本研究发现电针可能通过干预内质网应激减轻脑缺血再灌注损伤。
　　创新点：
　　以线栓法成功复制脑缺血再灌注损伤大鼠模型并采用电针百会、足三里穴干预，通过检测大鼠的神经功能情况和脑梗死体积，直观的验证了电针的有效性;并从内质网应激通路作为切入点，采用免疫组化、蛋白印迹、qPCR法分别从蛋白及基因水平检测脑组织中GRP78、CHOP、p-eIF2α、Caspase12等内质网应激通路上的重要指标的表达，探讨电针百会、足三里穴对脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织的保护作用机制，为电针干预缺血性脑卒中提供实验依据。
　　经国内外文献检索，尚未发现电针百会和足三里穴对脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织中内质网通路分子GRP78、CHOP、p-eIF2α、Caspase12的干预作用的研究。

目录

英文缩略词表

摘要

前言

第一部分 电针百会、足三里穴对脑缺血再灌注损伤大鼠的保护作用研究

一、实验材料

二、实验方法

三、实验结果

四、讨论

五、结论

第二部分 电针百会、足三里穴对脑缺血再灌注损伤大鼠内质网应激的影响

一、实验材料

二、实验方法

三、实验结果

四、讨论

五、结论

参考文献

附 综述 内质网应激与脑缺血再灌注损伤

附 临床资料分析 279例住院患者针灸会诊临床资料分析

个人简历

致谢

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