原发性甲状旁腺功能亢进症的外周血白细胞microRNA表达谱多发性内分泌腺瘤病1型相关的甲状旁腺肿瘤p27Kip1及β-连环蛋白的表达

摘要

本文主要从以下几个部分展开论述：
　　第一部分 原发性甲状旁腺功能亢进症的外周血白细胞microRNA表达谱
　　背景：原发性甲状旁腺功能亢进症(primary hyperparathyroidism，PHPT)是因甲状旁腺本身病变导致分泌过量甲状旁腺素的全身性疾病，病理类型多为良性的腺瘤(parathyroid adenoma，PA)，少数为增生及恶性的腺癌(parathyroid carcinoma，PC)。PC患者术后复发及死亡率高，然而术前鉴别PA及PC仍十分困难。多发性内分泌腺瘤病1型(multiple endocrine neoplasia type1，MEN1)是最常见的遗传性PHPT。microRNA(miRNA)是一类单链非编码小分子RNA，对基因进行转录后调控。外周血白细胞miRNA可作为分子标志物指导病理分型、预后等。
　　目的：1.寻找与散发性PA、PC以及MEN1相关的PHPT(MEN1related PHPT，MHPT)发病相关的外周血白细胞miRNAs。
　　2.寻找有助于术前鉴别PC与PA的外周血白细胞miRNAs分子标志物。
　　方法：1.研究对象：北京协和医院内分泌科确诊的22例散发性PA、14例散发性PC及16例MHPT患者。年龄、性别与PA组匹配的23例正常对照(normal control，NC)。
　　2.研究方法：(1)遗传分析：提取研究对象的外周血细胞总RNA和总DNA。应用Sanger测序对散发性PHPT患者进行MEN1基因、CDC73基因、CaSR基因、CDKN1B基因以及RET基因突变分析，排除遗传性PHPT。筛查MHPT患者的MEN1基因突变。(2)miRNA表达谱分析：应用Affymetrix miRNA4.0芯片（含2578个人成熟miRNA）分析各组中性别、年龄相匹配的6例对象的外周血白细胞miRNA表达谱，得到组间差异miRNAs（P＜0.05，差异倍数＞1.5或＜-1.5）。使用GCBI平台进行生物信息学分析。(3)结果验证：应用实时定量PCR(quantitative real time PCR，qRT-PCR)在22例PA、14例PC、16例MHPT患者以及23例NC中验证候选miRNAs的表达水平。
　　结果：1.PA组与NC组相比：①芯片：共有45个差异表达的miRNAs(同时满足Q＜0.05)，差异倍数在-3.259～2.818之间。②qRT-PCR验证：挑选14个miRNAs进行验证，PA组let-7e-5p、let-7f-5p及has-miR-1260b的表达水平显著升高，分别为NC组的3.01倍(P=0.028)、2.60倍(P=0.031)及1.98倍(P=0.043);miR-98-5p的表达在PA组呈上调趋势，为NC组的2.49倍(P=0.068)。
　　2.PC组与NC组相比：①芯片：共有37个差异表达的miRNAs，差异倍数在-3.309～2447之间。②qRT-PCR验证：挑选10个miRNAs进行验证，PC组的miR-4646-5p、miR-5196-5p及miR-6757-5p的表达分别是NC组的1.73(P=0.035)倍、1.84倍(P=0.033)及1.58倍(P=0.017)。
　　3.PC组与PA组相比：①芯片：共有64个差异表达的miRNAs，差异倍数在-2.421～2.498之间。②qRT-PCR验证：挑选15个miRNAs进行验证，校正性别后，miR-3136-3p及miR-5088-5p的表达在PC组呈上调趋势（P=0.070及0.076）。通过二元Logistic回归将性别分别与上述两个miRNAs进行建模，得到的新变量PRE_1及PRE_2有助于术前鉴别PC与PA（曲线下面积：0.776，0.805）。
　　4.MHPT组与NC组相比：①遗传分析：MHPT组中有10例携带MEN1基因突变。②芯片：共有30个差异表达的miRNAs，差异倍数在-2.614～2.244之间。③qRT-PCR验证：挑选7个miRNAs进行验证，MHPT组miR-1268b及miR-5194的表达水平显著低于NC组，分别为NC组的38.85％(P=0.001)及56.63％(P=0.004)。
　　结论：本研究首次探讨了PHPT的外周血白细胞的miRNA表达谱。与正常对照相比，PA组的let-7e-5p、let-7f-5p及has-miR-1260b的表达显著升高，PC组的miR-4646-5p、miR-5196-5p及miR-6757-5p的表达显著升高，MHPT组的miR-1268b及miR-5194的表达显著降低。这些异常表达的miRNAs可能有助于未来深入研究PHPT的发生、发展机制。miR-3136-3p及miR-5088-5p有望成为术前鉴别良恶性甲状旁腺肿瘤的分子标志物之一，但需要更大的样本量研究进行验证。
　　第二部分 多发性内分泌腺瘤病1型相关的甲状旁腺肿瘤p27Kip1及β-连环蛋白的表达
　　目的：分析p27Kip1及β-连环蛋白(β-catenin)在多发性内分泌腺瘤病1型(multiple endocrine neoplasia type 1，MEN1)相关的原发性甲状旁腺功能亢进症(primary hyperparathyroidism，PHPT)肿瘤组织中的表达，以探索其在MEN1相关的甲状旁腺肿瘤发病机制中的作用。
　　方法：收集2002年至2013年北京协和医院收治的31例MEN1相关的PHPT (MEN1 related PHPT，MHPT)患者的31份甲状旁腺肿瘤组织以及5份正常甲状旁腺(normal parathyroid，NP)组织的石蜡标本，应用免疫组织化学染色法检测p27Kip1及β-catenin蛋白的表达情况。
　　结果：MHPT肿瘤组织中，p27Kip1在细胞核表达为缺失、弱阳性或中等阳性（比例分别为12.9％、32.3％、54.8％）;细胞膜β-catenin表达为强阳性或中等阳性、细胞质β-catenin表达为中等阳性或弱阳性，未见有β-catenin表达于细胞核。MHPT组织p27Kip1表达水平显著低于NP组织(P=0.001)，但细胞膜及细胞质β-catenin的表达在MHPT组无显著性统计学意义(P值分别为0.087，0.357)。在MHPT组中，腺瘤亚组与增生亚组间p27Kip1与β-catenin的表达差异均无统计学意义。
　　结论：MEN1相关甲状旁腺肿瘤组织p27Kip1蛋白表达显著减少，而未发现β-catenin异位聚集于细胞核现象。

目录

摘要

缩略词表

第一部分 原发性甲状旁腺功能亢进症的外周血白细胞microRNA表达谱

前言

实验材料

研究方法

研究结果

一、散发性PHPT的外周血白细胞miRNA表达谱

二、MEN1相关的PHPT的miRNA表达谱

讨论

一、散发性PHPT的外周血白细胞miRNA表达谱

二、MHPT的外周血白细胞miRNA表达谱

三、与PHPT发病相关的信号通路

四、本研究的优势及局限性

结论

参考文献

第二部分 多发性内分泌腺瘤病1型相关的甲状旁腺肿瘤p27KiP1及β-连环蛋白的表达

前言

实验材料

研究方法

研究结果

讨论

结论

参考文献

论文综述 microRNA在甲状旁腺病理生理过程中的作用

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