高血压靶器官损害动态网络标志物--油酸对心肌重构的保护作用及机制研究

摘要

目的：心肌重构是在多种病理条件下左心室出现的结构和功能改变，通常与性别、遗传、血压等因素有关，但具体的发病机制尚不清楚。动态网络标志物(Dynamic network biomarker,DNB)理论作为分析多组学数据的新手段，通过分析多组学数据寻找与复杂疾病发生相关的关键物质或基因，从而为复杂疾病的发生机制和干预手段研究提供理论依据。本研究在利用DNB理论分析高血压及高血压心肌重构患者外周血代谢组学数据的基础上，寻找与高血压心肌重构发生密切相关的代谢分子并通过心肌重构细胞和动物模型对其功能和作用机制进行研究。 方法与结果：利用超高压液相色谱-飞行时间质谱(UPLC-Q/TOF-MS)检测高血压及高血压心肌重构患者外周血的代谢组学数据。PCA分析发现，有14种代谢物在高血压和高血压心肌重构患者的外周血中存在显著差异。使用DNB理论对得到的代谢组学数据进行分析，发现一个由71种代谢物构成的DNB网络，该网络在高血压到高血压心肌重构的病理变化中有超过50％的代谢物发生相变。通过这71种代谢物利用随机森林分类法对高血压和高血压心肌重构患者进行分类，当随机生成树的数量为240时，分类精度大于90％，满足分类的要求。此时，对应的分类特征数目为17，即利用这17种代谢物对两类患者进行分类的准确性可达90％以上。将DNB理论得到的结果与PCA分析结果取交集，共有五种可能与高血压心肌重构发生相关的代谢物，即：HOME，Oleic acid(OA)，PC(22∶6)，Sphingosine-1-phosphate和PC(20∶3)。文献报道富含油酸饮食可显著降低心血管事件风险，据此推测油酸可能对心肌重构具有保护作用。 使用血管紧张素Ⅱ(AngiotensinⅡ，AngⅡ)刺激心肌细胞和成纤维细胞并使用OA进行干预以验证OA对心肌重构的作用。AngⅡ刺激心肌细胞48小时后，心肌细胞表面积是正常细胞的2.1倍(P＜0.001)，而OA能够显著地抑制AngⅡ诱导的心肌细胞表面积增加（0.69倍，P＜0.001）。AngⅡ能够显著增加心肌细胞ANP和BNP的表达水平（2.0倍，P＜0.001;2.66倍，P＜0.01），而OA对AngⅡ诱导的ANP和BNP表达水平的增加具有显著地抑制作用(0.59倍，P＜0.05;0.48倍，P＜0.01)。AngⅡ诱导心肌成纤维细胞24小时后，Alpha-smooth muscle actin(α-SMA)、alpha-1typeⅠcollagen(COL1α1)和alpha-1typeⅢcollagen(COL3α1)的表达水平较正常细胞显著增加(2.53倍，P＜0.001;1.92倍，P＜0.01;4.25倍，P＜0.01)，而OA对此有显著地抑制作用(0.38倍，P＜0.001;0.55倍，P＜0.01;0.45倍，P＜0.01)。这些结果说明OA在体外对AngⅡ诱导的心肌重构具有保护作用。 在动物水平上，利用小鼠皮下植入AngⅡ微渗透泵的方式制备心肌重构动物模型并通过灌胃OA进行干预，实验共三组，即空白对照组（Blank组）、模型组(AngⅡ组)及油酸干预组（AngⅡ+OA组），每组20只雄性6-8周龄C57BL/6小鼠。AngⅡ微渗透泵植入1周后，小鼠的平均收缩压是175mmHg并持续整个实验周期，OA干预并未引起小鼠收缩压的改变(P＞0.05)。超声结果显示，AngⅡ能够显著升高小鼠心脏的LVPWd、LV Mass及E/E'IVS(1.25±0.18vs0.73±0.07，P＜0.001;157.3±23.34vs87.17±10.61，P＜0.001;41.53±12.22vs24.21±4.61，P＜0.001)，同时降低小鼠心脏的EF(％)和FS(％)(47.63±9.75vs58.45±6.23,P＜0.05;23.61±5.50vs30.74±4.44,P＜0.05)。OA对AngⅡ诱导组小鼠心脏LVPWd、LV Mass和E/E'IVS的升高及EF(％)和FS(％)的降低具有显著地抑制作用(P＜0.001)。OA对AngⅡ诱导的心肌肥厚反应具有显著地保护作用，这表现为OA干预组小鼠的心体比(mg/g)和心脏重量胫骨长度比(mg/mm)较正常对照组小鼠显著降低（5.52±0.63vs6.16±0.80，P＜0.05;8.82±0.67vs9.80±1.31，P＜0.05）。WGA染色结果显示，AngⅡ诱导组小鼠心肌细胞表面积是正常小鼠心肌细胞的1.99倍(P＜0.01)，而OA干预组小鼠心肌细胞表面积是AngⅡ诱导组小鼠的0.62倍(P＜0.01)。天狼星红染色结果显示，OA对AngⅡ诱导的心肌组织纤维化具有显著地抑制作用(3.22±2.23％vs5.56±4.25％，P＜0.05)。此外，OA干预组小鼠心肌组织中ANP和BNP的表达水平较AngⅡ诱导组小鼠显著降低(P＜0.05)。 为进一步探究OA保护心肌重构的分子机制，对不同处理组小鼠的心肌组织进行转录组测序。与正常小鼠比较，在AngⅡ诱导组小鼠心肌组织中上调的987个高表达基因中，有388个基因在OA干预组小鼠心肌组织中出现逆转，说明这些基因与OA的保护作用相关。对388个基因进行KEGG和GO分析后发现，成纤维细胞生长因子23（fibroblast growth factor23，FGF23）在AngⅡ诱导的心肌重构和OA的保护作用中发挥重要的作用。通过qPCR和ELISA检测小鼠心肌组织中的FGF23表达以对测序结果进行验证，结果显示，AngⅡ能够显著提高小鼠心肌组织中FGF23的表达（12.12±2.81vs3.44±0.67，P＜0.001;2.46倍，P＜0.01），而OA对AngⅡ诱导的FGF23表达具有显著地抑制作用（4.00±1.51vs12.12±2.81，P＜0.001;0.48倍，P＜0.01）。 体外研究显示，AngⅡ能够诱导FGF23在心肌细胞中的表达（60.33倍，P＜0.05），OA对此有显著地抑制作用（0.15倍，P＜0.05）。AngⅡ及OA对心肌成纤维细胞FGF23表达的影响较小（0.88倍，P＞0.05;1.11倍，P＞0.05）。FGF23能够在体外诱导心肌细胞的肥厚反应、增加ANP表达水平及活化PLCγ-NFAT1和TGF-β/β-Catenin信号（均P＜0.05），而OA能够显著抑制FGF23诱导的心肌细胞肥厚反应和上述信号通路的活化（均P＜0.05）。此外，FGF23在体外能够诱导成纤维细胞α-SMA和COL1α1的表达及TGF-β/β-Catenin信号的活化(P＜0.05)，而OA对此有显著地抑制作用(P＜0.05)。上述结果说明，OA能够显著抑制AngⅡ诱导的FGF23在心肌细胞中的表达，同时对FGF23诱导的心肌重构、PLCγ-NFAT1和TGF-β/β-Catenin信号的活化具有显著地抑制作用。 利用腺相关病毒9（Adenovirus Associated Virus-9，AAV-9）在小鼠体内全身过表达FGF23以研究FGF23对OA保护心肌重构的影响。本部分实验涉及6个实验组，即空白对照组：Ad-GFP-Blank组和Ad-FGF23-Blank组;AngⅡ诱导的模型组：Ad-GFP-AngⅡ组和Ad-FGF23-AngⅡ组;OA干预组：Ad-GFP-AngⅡ+OA组和Ad-FGF23-AngⅡ+OA组，每组20只雄性6-8周龄C57BL/6小鼠。AAV-9病毒注射3w后，心肌组织中FGF23的表达水平显著升高。AngⅡ微渗透泵植入1周后，小鼠平均收缩压为177mmHg，单纯AAV-9注射和OA干预未引起小鼠收缩压的改变(P＞0.05)。 OA能够显著抑制AngⅡ诱导的小鼠心体比增加（Ad-GFP小鼠：5.25±0.63vs6.00±1.01，P＜0.05;Ad-FGF23小鼠：5.80±0.82vs6.80±0.88，P＜0.05）。FGF23过表达使AngⅡ诱导组小鼠心体比显著增加（7.36±0.68vs6.21±0.91，P＜0.05，P＜0.05），同时，减弱了OA的保护作用（5.80±0.82vs5.25±0.63，P＜0.05）。不同处理组小鼠心脏重量与胫骨长度的比值也呈现相同的趋势。AngⅡ微渗透泵植入2周后，心肌组织中ANP和BNP表达水平显著增加(Ad-GFP小鼠：28.85倍，P＜0.001，3.17倍，P＜0.05;Ad-FGF23小鼠：47.28倍，P＜0.001，2.73倍，P＜0.05)，OA对AngⅡ诱导的小鼠心肌组织中ANP和BNP的表达具有显著地抑制作用(Ad-GFP小鼠：0.18倍，P＜0.001，0.44倍，P＜0.001;Ad-FGF23小鼠：0.28倍，P＜0.001，0.52倍，P＜0.01)。FGF23过表达对AngⅡ诱导组小鼠心肌组织中ANP的表达具有显著地促进作用（1.64倍，P＜0.05），但对BNP表达影响较小（0.86倍，P＞0.05）。 结论：高血压靶器官损害动态网络标志物-油酸在体内和体外对AngⅡ诱导的心肌肥厚和纤维化均具有显著地保护作用，该作用与OA抑制小鼠心肌组织中FGF23的表达及减弱心肌组织中PLCγ-NFAT1和TGF-β/β-Catenin信号有关，FGF23过表达显著加剧AngⅡ诱导的心肌重构，同时逆转OA对心肌重构的保护作用。