厚朴遗传多样性和遗传关系研究及ITS序列分析

摘要

厚朴（Magnolia officinalisRehd．et Wils）属木兰科（Magnoliaceae）木兰属（Magnolia）落叶乔木，被列为国家二级濒危保护植物。因其种类原始、分类地位特殊，且药用价值极高，而备受关注。随着社会对其需求量的增加，受利益的驱使，人们大量盗挖野生厚朴资源，致使目前其野生种群的数目和规模都在不断变小，呈散生状态，生境逐渐片断化，自然种群间的基因交流受阻，生存现状令人担忧，开展厚朴种群相关研究已迫在眉睫。
　　本文利用ISSR分子标记技术对厚朴种群遗传多样性和遗传关系进行研究，探索厚朴种群的遗传多样性及地域遗传分化，从分子水平揭示其濒危的原因，并提出相应保护策略；同时本文还利用ITS序列分析技术对11个主产区的厚朴ITS序列碱基变异进行了研究，为产区间厚朴的引种及道地性鉴定提供分子方面的证据。主要研究结果如下：
　　（1）厚朴基因组DNA提取方法研究结果
　　运用SDS-CTAB结合法、SDS法、CTAB法及高盐低pH法对厚朴基因组DNA进行提取，以SDS-CTAB结合法效果最佳，特别是高浓度NaAc的引入及相应冻融，可明显提高所得厚朴基因组 DNA纯度；同时采用石英砂和4％ PVP溶液代替液氮研磨叶片，也可达到较好效果。
　　（2）ISSR引物筛选及条件优化研究结果
　　通过正交试验确定了影响厚朴 ISSR-PCR反应的各项参数。其中扩增体系为：引物浓度0.3μmol?L-1，Taq酶0.04 U?μl-1，DNA浓度4 ng?μl-1，Mg2+与dNTP浓度分别为1.5和0.2 mmol?L-1；扩增程序为：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，50℃～60℃（退火温度随引物不同而定）退火45 s，72℃延伸90 s，共40个循环，然后72℃延伸8 min，4℃终止反应。最后，还利用该体系成功筛选出21条可用于厚朴遗传多样性及遗传关系研究的ISSR引物。
　　（3）不同产区厚朴ITS序列分析结果
　　对11个产区厚朴ITS序列分析发现，厚朴ITS全序列长度介于593～600bp（不考虑Gap，ITS1序列长度为214～217bp，ITS2序列长度为215～219bp，5.8S rDNA编码区极为保守，片段长度为164bp），并有33个变异位点（Gap做缺失处理，全部发生在ITS1和ITS2序列），且碱基频率及含量也呈现一定的变化（ITS1和ITS2序列GC含量分别为54.42%～55.35%和59.82%～60.95%，5.8S无变化，为46.95%）；遗传距离和聚类分析显示出部分厚朴产区间的亲缘关系，反映了我国厚朴全国引种栽培的现状。同时还发现产区间厚朴ITS序列位点变异与其叶形的变化不存在必然联系。
　　（4）厚朴种群遗传多样性及遗传关系分析结果
　　利用ISSR标记对28个厚朴种群666个个体进行扩增，开展厚朴遗传多样性及遗传关系研究，结果表明，12条ISSR引物均能在所有个体中稳定扩增，共扩增出137条带，其中114条为多态性条带，多态位点百分比（PPB）介于75.00%-91.67%；厚朴在物种水平拥有较高的遗传多样性（PPB=83.21%，H=0.342），而在种群水平遗传多样性却相对较低（PPB=49.76%，H=0.194），这可能与厚朴形成的特殊历史原因有关；28个厚朴种群间遗传多样性指标呈现差异，但各种群间的遗传多样性指标均与海拔、经纬度的变化无关（Pearson correlation test，P＞0.05）；28个厚朴种群间已经产生一定程度的分化，且种群内的遗传分化大于种群间（GST=0.4278）。AMOVA（Analysis of molecular variance）分析结果与其相吻合，并且表明厚朴种群间和种群内均发生了显著的遗传分化（AMOVA analysis，P<0.001）；基于Nei遗传距离进行的NJ聚类，28个厚朴种群明显的被分为3组，与Structure遗传结构分析及主坐标分析（PCoA，2Dim and3Dim）结果相吻合；基于种群地理距离自然对数和遗传距离的Mantel检测表明，厚朴种群的遗传分化（R=-0.0054，P=0.5120）不符合距离产生分化模型。

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表目录

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第一章 绪 论

1.1引言

1.2研究目标和主要研究内容

1.3研究技术路线

第二章 不同方法对厚朴叶片总DNA提取效果的影响

2.1材料与方法

2.2 结果与分析

2.3 小结

第三章 厚朴ISSR引物筛选及反应条件优化

3.1材料与方法

3.2 结果与分析

3.3 小结

第四章 不同产区厚朴ITS序列分析

4.1 材料和方法

4.2 结果与分析

4.3 小结

第五章 厚朴种群遗传多样性及遗传关系分析

5.1 材料和方法

5.2 结果与分析

5.3 小结

第六章 结论与讨论

6.1 不同方法对厚朴叶片总DNA提取效果的影响

6.2 厚朴ISSR引物筛选及反应条件优化

6.3 不同产区厚朴ITS序列分析

6.4 厚朴遗传学分析

6.5 展望

参考文献

在读期间的学术研究

致谢