日本落叶松×长白落叶松无性系间生根差异的分子机制

摘要

无性繁殖是现代林业发展的前提。扦插是林木无性繁殖的主要方式，优良品种进行良种繁育的关键是扦插生根技术。尤其是针叶树，扦插生根率低，是制约利用扦插进行无性系林业发展的瓶颈。迄今对扦插生根的研究虽然已在生理生化的水平上取得一定进展，但其生根相关的关键机理仍不清楚。随着分子生物学技术的发展，从分子水平上探讨生根机理、分离生根相关基因及探讨这些基因的功能，进而揭示林木扦插生根机制，为利用基因工程育种手段改良林木提供科学依据，具有重要的科学意义和应用价值。本研究选生根率差异较大的2个落叶松全同胞无性系，取IBA处理后6h、不定根原基发生、不定根生长等不同根发育阶段的落叶松插穗基部为材料，利用抑制消减杂交技术构建了落叶松扦插生根过程差别表达cDNA文库。经过测序、DNASTAR软件序列拼接获得UniEST，并利用GenBank数据进行同源性比对；应用半定量PCR和实时定量PCR技术，进一步研究与分析IAAOL1、RGAOL等基因表达情况。通过简并引物技术，克隆部分基因全长并应用DNASTAR软件构建进化树。主要结果如下：
　　（1）落叶松扦插生根实验表明，落叶松插穗扦插后10d后部分长出愈伤组织，25d时可见不定根根原基，至80d后插穗根系基本形成，生根率在17.18％—90.63%之间。我们根据上述根发育过程，确定了本研究的取材时期为：经IBA处理后6小时、扦插后30d和扦插后50d。
　　（2）成功构建了正、反2个差别表达cDNA文库，经测序和生物信息学分析，共获得521个UniEST，其中正库272个UniEST，反库249个UniEST。正库中164个和反库中179个UniEST与GenBank中的序列具有同源性，这些序列包括新陈代谢、信号途径、物质运输、抗性相关、生长发育、亚细胞组成等6类基因，占所获基因总数的65.8％。
　　（3）序列比对表明，在所获得的521个UniEST中共包含10个激素相关基因片段。其中6个与生长素相关；2个与赤霉素相关；1个与ABA相关；1个与茉莉酸相关。在6个生长素相关基因片段中，2个为AUX/IAA基因家族成员；1个为NAC基因家族成员；其它3个为生长素响应基因。表明激素在植物器官发生过程中起到关键作用。
　　（4）除激素相关基因外，落叶松扦插生根过程还包括信号转导、物质运输、能量代谢、细胞周期等相关基因的时空表达变化。半定量PCR分析表明，小G蛋白在落叶松扦插形成不定根的信号传递中发挥作用。另外，小G蛋白和ABC转运蛋白在落叶松扦插形成不定根的物质运输方面发挥作用。扦插过程中产生的因伤诱导物质对落叶松扦插形成不定根具有促进作用。
　　（5）IAAOL1和IAAOL2基因半定量分析表明，二者均在落叶松根、茎和叶中均表达。IBA处理后，这2个基因表达水平均提高，说明二者为生长素响应基因。在落叶松扦插生根的各个时期，IAAOL1基因在L1中表达量均明显高于其在L2中的表达量；IAAOL2基因在L2中表达量均明显高于其在L1中的表达量。
　　（6）激素处理实验表明，在NAA浓度为1×10-3M时，IAAOL1和IAAOL2基因表达量均明显高于对照。不同激素处理时，二者均在生长素处理时高表达。在不同生长素处理时，NAA处理诱导这2个基因高水平表达。在表达时间上，这2个基因均在NAA处理24h后表达量明显升高。上述结果表明，IAAOL1和IAAOL2基因为生长素早期响应基因。结合二者在落叶松扦插生根各个时期的表达情况分析表明，IAAOL1和IAAOL2基因具有促进落叶松扦插不定根发生的作用。
　　（7）赤霉素相关基因半定量分析表明，在L1中，与赤霉素合成相关的GA20OL基因在IBA处理后和不定根根原基形成表达量高于其它时期；在L2中，该基因在IBA处理后表达量最高，在不定根生长初期表达量最低。与之相对应，在L1中，RGAOL基因在扦插生根各个时期表达量均很低；在L2中，该基因在扦插生根各个时期表达量均很高，且以IBA处理后和不定根根原基形成时期表达量最高。表明在落叶松扦插形成不定根过程中，赤霉素可通过降解植物生长发育抑制物质DELLA蛋白促进不定根的生长发育。
　　此外，本研究还获得了大量功能未见报道的新基因，如在所获得的UniEST中，34.2%的基因不能在已有数据库中找到高度同源序列。说明在落叶松扦插形成不定根过程中还有很多基因水平的变化还不清楚。对这些未知基因进行研究可为落叶松扦插生根分子机理研究的深入探讨、优良基因的发现及利用奠定基础。

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第一章 绪 论

1.1引言

1.2国内外研究现状与评述

1.3研究目标和主要研究内容

1.4研究技术路线

第二章 落叶松扦插生根过程SSH文库构建及诠释

2.1材料与方法

2.2实验结果

2.3讨论

2.4小结

第三章 落叶松部分生根相关基因表达调控分析

3.1材料和方法

3.2实验结果

3.3讨论

3.4小结

第四章 IAAOL1和IAAOL2基因表达分析

4.1材料与方法

4.2实验结果

4.3讨论

4.4 小结

第五章 结论与展望

参考文献

附录

在读期间的学术研究

致谢