日本落叶松small RNA分析与体细胞胚发生过程中microRNA及其目标基因的鉴定与表达

摘要

植物体细胞胚发生是针叶树优良品种应用及规模化繁殖的主要途径，也是基因工程的桥梁，在细胞全能性表达、种质保存、林木更新等诸多领域均具有重要科学意义和应用价值。然而，胚性细胞诱导难度大、畸形胚比例高、难以同步化等关键问题成为体细胞胚应用于生产的瓶颈。虽然在影响其发生的生理生化因子、分离并鉴定相关基因等针叶树体细胞胚发生机制方面进行了很多研究，但仍不足以解决生产中存在的基础理论问题。microRNA(miRNA)及其它small RNA(sRNA)作为上层调控因子在胚胎发生过程中起重要作用，可能成为解决体细胞胚发生难题的新突破口。本研究取日本落叶松(Larix leptolepis)胚性细胞系O638＃的8个发育阶段胚性培养物为实验材料，构建体细胞胚sRNA文库并进行Solexa测序，应用生物信息学方法分析了sRNA、鉴定了miRNA及其目标基因，进行了ta-siRNA与long sRNA鉴定、miRNA降解和3’端碱基添加分析等；PAGE分离了落叶松8个生长阶段中的sRNA；RACE技术验证miRNA目标基因和克隆miRNA前体；qRT-PCR分析了miRNA、miRNA前体和miRNA目标基因在体细胞胚8个发育阶段的表达，进行了RDR2和RDR6落叶松8个生长阶段中的表达分析。主要结果如下：
　　1.落叶松体细胞胚sRNA文库的Solexa测序获得原始序列20427626条（非冗余序列2485006条），去除无意义序列后剩余18555811(2201297)条序列(16-~30-nt)；比对到已知RNA的序列分别占冗余序列和非冗余序列的44.44％和9.61%，其中比对到重复序列的sRNA数量最多，其次是rRNA；剩余的10343196(2000546)条序列中，24-nt sRNA丰度最高，占非冗余序列的57%，表明针叶树可产生丰富的24-nt sRNA；且24-nt sRNA冗余度最低，每个非冗余序列的平均拷贝数仅1.82，表明落叶松体细胞胚发育中24-nt sRNA位点的多样化。落叶松不同生长阶段的sRNA的PAGE分离表明sRNA种类及长度分布具有生长阶段差异性，可能与RDR2和RDR6差异表达有关。
　　2.分析sRNA序列，鉴定了83个保守落叶松miRNA，来自35个家族，其中miR946、miR947和miR950等12个家族推测为针叶树特异miRNA；发现了16个新miRNA和14个候选miRNA，96.3%为落叶松特异miRNA。序列比对和RACE技术获得了27个保守miRNA、27个新miRNA或候选miRNA的前体序列；物种间序列比对表明miRNA前体中非成熟序列在物种间差异显著，与亲缘关系相关。进一步预测了110个miRNA目标基因，并运用5’RACE验证了11个目标基因，切割位点多位于第10与11碱基间。
　　3. qRT-PCR分析表明，91.4%miRNA表达次高峰在后期单胚或早期子叶胚，中期子叶胚最低，最高峰在后期子叶胚，分别与子叶形成、胚胎后熟、胚胎休眠的生理活动相吻合；miRNA前体的表达模式不同于miRNA，变化幅度小于成熟体，miRNA成熟体表达与前体含量不成线性相关，回归分析时Cubic三次多项式拟合程度最好，可能受多重调控；目标基因mRNA整体变化幅度小于miRNA，表达最高峰多在后期单胚或早期子叶胚，最低水平在后期子叶胚（成熟胚胎），目标基因 mRNA丰度与miRNA含量呈负相关，仅miR390-TAS3达到显著水平，且某些发育阶段存在“共表达”现象，表明miRNA和目标基因相互作用的复杂性。
　　4.通过sRNA序列的siRNA分析，鉴定了miR390切割TAS3产生的ta-siRNA，各ta-siRNA在体细胞胚sRNA文库的拷贝数变化很大（0~320），最高丰度分别为3’D4、3’D10和3’D16 ta-siRNA，其中3’D10 ta-siRNA潜在目标基因为ARF。qRT-PCR分析表明这3个ta-siRNA表达最高峰在成熟体细胞胚，体细胞胚萌发后含量急剧降低，且在后期生长发育中维持较低水平。另外发现了两个新ta-siRNA位点，分离出一系列ta-siRNA。MIR位点深入分析发现一些MIR位点具有双重功能，同时产生miRNA（21-~22-nt）和long sRNA(23-~26-nt），long sRNA产生比率与MIR基因保守性表现为负相关。
　　5.缩减体（truncated）miRNA分析表明，miRNA可从两端降解，66%miRNA从3’-5’降解频率高于5’-3’方向，且不同miRNA家族或同一家族不同成员间miRNA降解频率不同，表明落叶松miRNA降解受到复杂机制调控。miRNA异构体（isomiR）分析表明miRNA存在3’端腺嘌呤（A）、尿嘧啶（U）、胞嘧啶（C）核苷酸添加现象，体细胞胚中miRNA位点倾向于加C（实生苗倾向于加A），这是首次在植物中报道miRNA3’端胞嘧啶添加；miR397a和 llemiR-7在体细胞胚发育过程中 isomiR-C较丰富（miR950b-5p-C在实生苗中水平较高），表明特异miRNA3’端胞嘧啶添加在植物生长发育过程中具有生物学意义；miRNA3’端碱基添加率与miRNA表达量不相关，表明“isomer-X”不是随机发生或前体序列的降解产物；体细胞胚（实生苗）中，77.8%（81.8%）miRNA的isomiR-U比例高于isomiR-A和 isomiR-C，表明成熟miRNA的尿嘧啶添加在落叶松中普遍存在，具有生物学意义。
　　综上所述，落叶松等针叶树有着陆地植物保守的sRNA发生途径，落叶松不仅有植物保守miRNA，同时拥有针叶树或裸子植物特异miRNA，且进化出本物种特异miRNA。这些 miRNA及其目标基因在落叶松体细胞胚发生过程中差异表达。此外，落叶松也存在ta-siRNA、long sRNA等其它sRNA，这些sRNA可能参与了落叶松体细胞胚发育过程的复杂调控。

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第一章 绪 论

1.1 引言

1.2 植物miRNA的研究现状

1.3 miRNA在胚胎发育中调控作用研究进展

1.4 研究目标和主要研究内容

1.5 研究技术路线

第二章 落叶松体细胞胚sRNA文库构建、Solexa测序及分析

2.1 材料与方法

2.2 结果分析

2.3 讨论

2.4 小结

第三章 落叶松microRNA的鉴定、前体及目标基因分析

3.1 材料与方法

3.2 结果分析

3.3 讨论

3.4 小结

第四章 落叶松体细胞胚发育中miRNA、前体及目标基因的表达分析

4.1 材料与方法

4.2 实验结果

4.3 讨论

4.4 小结

第五章 落叶松ta-siRNA与long sRNA的鉴定与分析

5.1 材料与方法

5.2结果分析

5.3 讨论

5.4 小结

第六章 落叶松miRNA降解与3’端碱基添加分析

6.1 材料与方法

6.2 结果分析

6.3 讨论

6.4 小结

第七章 结论与讨论

7.1 结论

7.2 讨论

7.3 展望

参考文献

附录 缩略词

在读期间的学术研究

致谢