山鸡椒转录组和表达谱的分析及其再生体系的建立

摘要

山鸡椒[Litsea cubeba(Lour.) Pers.]是我国珍贵的芳香油料和药材树种，目前对于其主要成分——萜类化合物生物合成途径中关键酶的研究报道还较少，与已发现的萜类数量相差甚远。本研究利用第二代测序技术对山鸡椒不同组织和不同发育时期的果实进行研究，以期丰富山鸡椒的基因资源，通过筛选山鸡椒果实发育过程中的差异表达基因并进行功能注释，可为进一步的基因功能研究提供参考。同时，根据转录组的测序结果，进行山鸡椒的内参基因筛选，为山鸡椒的基因表达水平分析提供了可靠的内参系统。此外，建立了山鸡椒的植株再生体系，为山鸡椒遗传转化体系的建立及进一步的品种改良研究奠定基础。 转录组测序后，获得36618326个原始读序，通过数据拼接及组装，分别得到1973896条Contig，99060条转录本和68648个Unigene。将转录组的序列数据通过BLASTX比对到公共数据库中，56％的Unigene得到功能注释，其中25340个Unigene可以比对到GO数据库中，9803个Unigene可以比对到COG数据库中，7702个Unigene比对到KEGG的297个通路中。通过PlnatCyc数据库预测山鸡椒代谢途径，其中与萜类生物合成相关的MVA途径占23.16％，并从转录组序列中找到了61个与萜类化合物生物合成相关的Unigene。 对5个不同发育时期果实进行数字基因表达谱测序，共获得43163105条reads，平均每个文库的序列数量为8632621。以山鸡椒转录组序列作为参考基因序列进行比对，各个文库比对上的比例均达到87％以上。对DGE数据进行差异表达基因的检测，所有时期果实样品间的差异表达基因数量为19354个，随机选取5个萜类合成相关的基因对DGE的测序结果进行实时荧光定量PCR的验证，结果表明DGE的结果具有较高的可靠性。 从转录组测序结果中筛选了12个候选内参基因(ACT7，ACT11，EF1α，EIF4α，F-BOX，GAPDH，SAMDC，TCTP, TUA，UBC，UBQ)，以山鸡椒不同组织及不同发育时期的果实为材料，探讨了这些候选基因的表达稳定性。在所有样品的分析中，F-BOX，EF1α，UBC和TUA的表达最为稳定。以EF1α，UBC和SAMDC为内参，检测了两个目的基因（DXR和DXS）的相对表达量，验证了EF1α和UBC作为稳定内参的可靠性。这些内参基因对于山鸡椒基因表达的定量分析具有重要的参考价值。 以山鸡椒无菌苗叶片、茎段为外植体诱导愈伤组织，通过愈伤组织分化诱导不定芽途径，建立山鸡椒植株再生体系，以期为山鸡椒遗传转化奠定基础。结果表明，山鸡椒茎段是诱导愈伤组织最佳外植体，诱导和分化培养基为MS+BA2.0 mg·L-1+IBA0.1mg·L-1，分化培养基中添加适当浓度的维生素C可减轻愈伤组织褐化程度;诱导不定芽生根较理想的培养基为1/2 MS+IBA0.2 mg·L-1+NAA0.4 mg·L-1。同时，通过组织学观察了愈伤组织的结构和不定芽的发生。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 引言

1．1．1 山鸡椒的研究进展

1．1．2 萜类生物合成途径及其关键酶的研究

1．1．3 第二代测序技术及其在转录组和表达谱研究中的应用

1．1．4 樟科植物组织培养的研究

1．2 研究的目的意义及主要内容

1．2．1 研究的目的意义

1．2．2 研究的主要内容

1．3 研究的技术路线

第二章 山鸡椒转录组分析

2．1 材料与方法

2．1．1 植物材料

2．1．2 实验试剂及仪器

2．1．3 山鸡椒总RNA的提取

2．1．4 转录组测序

2．2 结果与分析

2．2．1 测序数据组装的结果

2．2．2 山鸡椒转录组数据的分析

2．3 讨论

2．4 本章小结

第三章 山鸡椒不同发育时期果实的DGE测序

3．1 材料与方法

3．2 不同发育时期果实DGE分析

3．2．1 测序结果统计

3．2．2 基因表达定量分析

3．2．3 果实发育不同时期差异表达基因分析

3．2．4 荧光定量分析

3．3 讨论

3．4 本章小结

第四章 山鸡椒实时荧光定量PCR分析中适宜内参基因的筛选

4．1 材料与方法

4．1．1 植物材料

4．1．2 实验试剂及仪器

4．1．3 山鸡椒总RNA的提取和cDNA合成

4．1．4 目的基因的选择及引物设计

4．1．5 目的片段普通PCR及测序验证

4．1．6 荧光定量PCR及数据分析

4．2 结果与分析

4．2．1 内参基因的PCR扩增及序列验证

4．2．2 内参基因的Ct值和表达稳定性分析

4．2．3 内参基因稳定性验证

4．3 讨论

4．4 本章小结

第五章 山鸡椒的愈伤组织诱导及植株再生

5．1 材料与方法

5．1．1 植物材料

5．1．2 实验试剂及仪器

5．1．3 方法

5．2 结果与分析

5．2．1 不同外植体愈伤组织的诱导

5．2．2 愈伤组织不定芽的诱导

5．2．3 不定芽生根培养

5．2．4 不定芽再生的组织学观察

5．3 讨论

5．4 本章小结

第六章 结论与展望

6．1 结论

6．2 展望

参考文献

攻读学位期间的学术研究

致谢