油桐NF-YB转录因子基因家族的分离及VfLEC1对拟南芥的遗传转化

摘要

油桐（Vernicia fordii）是世界上重要的工业油料树种，生产的桐油广泛用于制漆、塑料、人造橡胶、油墨等行业，同时由其安全、可再生、环保等特点而被视为重要的生物柴油原料。油桐在常规育种方面如丰产造林及栽培选优取得了重要的研究进展，但桐油合成有关的分子生物学研究较浅。利用分子技术挖掘油脂合成相关功能基因有助于阐明桐油生物合成分子机制，辅助油桐育种。NF-YB基因家族是一类广泛存在于真核生物中的转录因子，功能涉及胚胎发育、花期调控、种子成熟、脂肪酸合成、抗旱性、根的延长、光和色素的合成等方面。转录因子LEC1是NF-YB家族成员之一，在油脂合成过程中发挥着重要作用。本论文从木本油料植物油桐中克隆了油桐NF-YB家族7个基因，进行了基因结构、蛋白结构、同源性及进化树分析，并分析了组织表达特异性。此后，选取其中VfNF-YB14（VfLEC1）基因，构建含有种子特异表达启动子的重组载体，成功获得了转VfLEC1基因的拟南芥植株，对其进行初步的功能鉴定。获得的主要结果如下:
　　(1)油桐中VfNF-YB基因家族7个成员的分离与结构分析。以油桐叶片DNA为模板，根据转录组测序获得的序列设计基因特异性引物，扩增获得VfNF-YB基因家族7个成员的DNA序列。结果显示，VfNF-YB1，7，9，11，13，14没有内含子，VfNF-YB5有3个内含子。用DNAman软件分析VfNF-YB基因家族氨基酸的相似度，发现用保守B区域进行比对，和用全长氨基酸进行比对相比较，显示更高的相似度，说明VfNF-YB基因家族在B区域外的相似度低。此外，VfNF-YB1属于LEC1-类，剩余的属于非LEC1类。对多物种的NF-YB家族进行氨基酸比对发现，它们具有共同的保守B区域，系统进化树结果显示，VfNF-YB1/VfNF-YB5和VfNF-YB7/VfNF-YB13相似度接近，VfNF-YB11和VfNF-YB7/VfNF-YB13相似度接近，然而VfNF-YB9则和他们相似度较低。对VfNF-YB基因家族成员的蛋白质结构三维结构预测分析，提示并7条系列可能组成复合物发挥作用。
　　(2)油桐中VfNF-YB基因家族的表达分析。组织表达分析结果表明，VfNF-YB1，5，11在种仁中的相对表达量高于在其他组织，VfNF-YB7，9在根中表达量最高且在其他组织中表达量较低。VfNF-YB13在各个组织中表达量差异不大。VfNF-YB14主要在根，茎，叶维管组织，以及成熟早期种子中高表达。
　　(3)转录因子VfLEC1基因的表达分析。基因在不同的组织中均有表达，在不同的组织中的表达表现为:叶＞茎＞根＞种子＞花＞子房＞幼果＞雄蕊。VfLEC1基因的表达具有时间特异性，在桐油的合成初期表达量最高。基因结构显示其无内含子结构，共编码242个氨基酸。预测的等电点为6.91，分子量为27.03kD。氨基酸比对结果显示油桐也具有保守B区域，并且具有保守的16个氨基酸残基(M，I，R，H，D，I，Y，N，D，R，Q，T，A，E，K，T)，保守区域有3个α-螺旋(α1-3)以及2个连接区域(L1，L2)。进化树分析显示油桐VfLEC1与蓖麻LEC1进化关系距离最近。
　　(4)转录因子VfLEC1基因对拟南芥的遗传转化。成功构建含有特异性种子表达启动子的植物表达载体pB110-VfLEC1，并根据生长情况及AtLEC1的表达量选取合适的突变体，将VfLEC1基因成功转入突变体拟南芥lec，获得了8株阳性表达转化子，表达量在转化子间差异明显，表达量最高的株系LEC1-7是表达量最低株系LEC1-4的十倍左右。突变体、野生型及转VfLEC1基因的拟南芥植株在幼苗初期表型不明显。至生长中期，转基因拟南芥植物与野生型拟南芥相比，植株抽薹早，开花早，与突变体拟南芥相比，植株抽薹晚，开花晚，茎细。生长后期的转基因拟南芥与突变体拟南芥相比，植株立性较差，分枝较多。突变体、野生型及转VfLEC1基因的拟南芥种子外观差异不大，转基因种子千粒重稍重，长度、宽度数值也稍大。种子中的脂肪酸含量及成分分析有待后续的测定，从而揭示转录因子VfLEC1在油脂合成生物调控中的作用。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 引言

1．1．1 研究背景

1．1．2 油桐分子生物学研究基础

1．1．3 与脂肪酸合成相关的转录因子的基础研究

1．1．4 转录家族NF-YB／HAP3／CBP的研究

1．1．5 转录因子LEC1的研究

1．2 本研究的目的意义与研究内容

1．2．1 研究的目的与意义

1．2．2 主要研究内容

1．2．3 研究技术路线

第二章 油桐VfNF-YB转录因子基因家族的基因克隆与表达分析

2．1 材料与方法

2．1．1 实验材料

2．1．2 主要试剂及仪器

2．1．3 实验方法

2．1．4 主要研究工具

2．2 结果与分析

2．2．1 油桐NF-YB转录因子转录因子基因家族的克隆

2．2．2 油桐NF-YB的基因及蛋白结构

2．2．3 NF-YB转录家族的氨基酸比对及进化树分析

2．2．4 油桐VfNF-YB转录因子基因家族氨基酸相似度分析

2．2．5 油桐各组织中VfNF-YB的表达谱分析

2．3 讨论

2．4 小结

第三章 油桐转录因子VfLEC1(VfNF-YB14)对拟南芥的遗传转化

3．1 材料与方法

3．1．1 实验材料

3．1．2 主要试剂与仪器

3．1．3 试验方法

3．2 结果与讨论

3．2．1 VfLEC1基因的克隆

3．2．2 油桐种子含油量分析及VfLEC1在不同发育时期的种仁中的表达

3．2．3 油桐VfL3C1在不同组织中的表达

3．2．4 油桐VfLEC1的基础信息学分析

3．2．5 植物表达载体pB110-VfLEC1的构建

3．2．6 拟南芥突变体的鉴定和筛选

3．2．7 VfLEC1转基因拟南芥的鉴定

3．2．8 VfLEC1转基因拟南芥的表型分析

3．3 讨论

3．4 小结

第四章 结论与展望

4．1 结论

4．2 展望

参考文献

在读学位期间的学术研究

致谢