基于DNA条形码的濒危木材识别技术研究

摘要

随着全球森林资源贸易量的急剧增加，木材尤其是热带木材物种已迅速成为《濒危野生动植物种国际贸易公约》(CITES)近年来关注的焦点。开展木材识别技术研究，实现其科学与准确识别，是保护濒危木材资源的关键技术基础。仅依靠传统木材解剖技术，一般只能识别木材到“属”或“类”，无法实现“种”的识别。最新发展的木材DNA条形码识别技术为解决这一科学难题提供了可能。尽管植物DNA提取与分析技术已日趋成熟，但对于经过干燥加工或长期存储的木材，则很难获得高质量的DNA。本论文针对干燥处理或长期存储的木材组织，通过突破DNA高效提取技术瓶颈，并优选确定DNA条形码，以实现濒危木材“种”的识别。
　　本研究通过优化温浴时间、木粉量与DNA裂解液体积比、裂解液化学成分等技术参数，改进了木材DNA提取技术;并定量比较改进的CTAB法与改进的Qiagen试剂盒法，优选了木材DNA提取方案，初步建立了木材DNA提取技术体系。利用聚合酶链式反应(PCR)，对多条短DNA片段进行扩增;通过BLAST序列比对及构建系统进化树，优选确定了适用于木材识别的DNA条形码类型及片段长度，并分析了干燥处理及存储时间等因素对木材DNA的影响。基于筛选确定的DNA条形码，实现了濒危木材“种”的科学准确识别，推动了木材识别新技术的发展，同时也为我国提高CITES公约履约能力提供了关键技术支撑。
　　主要结果归纳如下:
　　(1)初步建立了以改进的Qiagen试剂盒法为基础的木材DNA提取技术体系。本研究以杉木(Cunninghamia lanceolata(Lamb.) Hook.）为实验对象，采用延长木粉温浴时间、减小木粉量与DNA裂解液体积比、优化裂解液的化学成分、多份DNA裂解液过同一DNA吸附柱等改进措施，形成了优化的木材DNA提取技术。同时，确定了改进的Qiagen试剂盒DNA提取方法优于改进的CTAB法。研究结果为进一步开展木材DNA识别工作提供了高效DNA提取技术基础。
　　(2)确定了木材不同径向位置对DNA提取的影响。从木材边材到心材，DNA含量呈减少趋势;从木材边材和心边材过渡区提取的DNA纯度通常高于心材DNA。
　　(3)针对80℃和120℃不同温度干燥处理的白木香(Aquilaria sinensis(Lour.) Gilg）木材，采用改进的Qiagen试剂盒法进行木材DNA提取，分析了干燥处理对木材DNA的影响。经过80℃干燥处理后的木材边材及心材，长度为300-500 bp的叶绿体及细胞核核糖体DNA片段依然能PCR扩增成功;但经过120℃干燥处理后，木材边材叶绿体及细胞核核糖体DNA片段能成功扩增，而心材DNA片段却未扩增成功。高温加速DNA分子链酶解、水解及氧化反应，导致DNA降解成小片段分子，需扩增目的片段可能被降解。
　　(4)选取30年、57年、80年和3600年等不同存储年限的胡杨(Populus euphraticaOliv.)木材，通过PCR扩增一系列不同长度的DNA片段，评估了不同存储时间木材DNA的保存状况。对于存储30年的木材标本，长度为100-800 bp之间的DNA片段均能PCR扩增成功;存储57年的木材标本，仅长度200 bp左右或更短的叶绿体DNA片段成功扩增;存储80年的木材标本，仅长度100 bp左右的叶绿体DNA片段成功扩增;而对于存储3600年的考古木材，即使长度约100 bp的叶绿体DNA片段也未扩增成功。随着存储时间的延长，由于水解反应、氧化反应以及微生物分解作用，木材DNA逐渐降解成小片段分子。
　　(5)筛选确定了适用于木材识别的DNA条形码类型及片段长度。针对不同树种及不同存储状况的木材，应选择适于鉴别物种的不同类型及长度的DNA条形码。本研究中，能有效识别白木香木材的DNA条形码为trnL-trnF和ITS1;DNA条形码rbcL及ITS或者多个短DNA条形码组合适用于鉴别胡杨木材;DNA条形码trnL比matK和psbA-trn更适用于区分微凹黄檀（Dalbergia retusa Hemsl.）、危地马拉黄檀（Dalbergia tucurensisDonn.Sm.）及交趾黄檀（Dalbergia cochinchinensis Pierre）这3种黄檀属木材的识别条形码。此外，综合木材DNA降解和DNA片段识别信息位点数等因素，建议选择的DNA条形码长度为200-500 bp。
　　(6)基于DNA条形码技术可成功实现木材“种”的准确识别。通过优选的DNA条形码构建最大简约树或邻接树等系统进化树，能够实现濒危树种白木香木材，长期存储胡杨木材，及微凹黄檀、危地马拉黄檀和交趾黄檀等3种濒危黄檀属木材“种”的识别。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 引言

1．1．1 研究背景

1．1．2 国内外研究现状及评述

1．2 研究目标和主要研究内容

1．2．1 关键的科学问题与研究目标

1．2．2 主要研究内容

1．3 研究技术路线

第二章 木材DNA提取方法建立

2．1 材料和方法

2．1．1 样品制备

2．1．2 DNA提取

2．1．3 DNA定量检测

2．1．4 PCR扩增

2．1．5 组织化学分析

2．1．6 数理统计

2．2 结果与讨论

2．2．1 木材DNA提取方法优化

2．2．2 木材DNA提取

2．2．3 PCR扩增

2．2．4 改进CTAB法与改进Qiagen试剂盒法比较

2．2．5 木材组织细胞核和造粉体分布

2．3 小结

第三章 干燥处理木材的DNA条形码识别

3．1 材料与方法

3．1．1 实验材料

3．1．2 光学显微分析

3．1．3 木粉制备

3．1．4 DNA提取

3．1．5 DNA定量数理统计

3．I．6 引物设计

3．1．7 PCR扩增

3．1．8 PCR产物的纯化、克隆、测序

3．1．9 序列比对及系统进化树构建

3．2 结果与讨论

3．2．1 白木香属木材构造特征

3．2．2 DNA提取与PCR扩增

3．2．3 序列比对与系统进化分析

3．2．4 DNA条形码的筛选与评价

3．3 小结

第四章 长期存储木材的DNA条形码识别

4．1 材料与方法

4．1．1 实验材料

4．1．2 实验方法

4．2 结果与讨论

4．2．1 胡杨木材构造特征

4．2．2 长期存储及考古胡杨木材DNA定量分析

4．2．3 PCR扩增

4．2．4 序列比对

4．2．5 系统进化树构建

4．3 小结

第五章 濒危黄檀属木材的DNA条形码识别

5．1 材料与方法

5．1．1 实验材料

5．1．2 实验方法

5．2 结果与讨论

5．2．1 黄檀属木材构造特征

5．2．2 DNA提取与PCR扩增

5．2．3 序列比对与系统进化分析

5．2．4 DNA条形码的筛选与评价

5．3 小结

第六章 结论与讨论

6．1 结论

6．1．1 构建木材DNA提取技术体系

6．1．2 干燥处理对木材DNA的影响

6．1．3 存储时间对木材DNA的影响

6．1．4 优选适用于木材识别的DNA条形码

6．1．5 基于系统进化树实现濒危木材“种”的准确识别

6．2 创新点

6．3 展望与建议

参考文献

在读期间的学术研究

致谢