山茶花生殖生物学及倍性育种基础研究

摘要

本文以亚热带林业研究所山茶资源圃、金华国际山茶物种园和南宁金花茶公园的山茶属615个种质作为研究对象，首次从山茶属植物倍性调查鉴定、倍性与形态关系、繁育系统、花粉贮藏生理、花粉加倍及杂交不育等方面对山茶生殖生物学、倍性育种、杂交不育等进行了系统研究，主要结论如下:
　　615个供试山茶属种质流式细胞仪倍性检测结果如下:二倍体512个，主要包括:耐冬山茶(Naidong(C.japonica)）、杜鹃红山茶（C.azalea）、金花茶(C.nitidissima)、越南抱茎茶(C.amplexicaulis、南山茶(C.semiserrata)、红露珍（C.japonica' hongluzhen'）、白灵山红山茶（C bailinshanica）、浙江红山茶（C.chekiangoleoso Hu）等;单倍体1个:单体红山茶(C.ufaku);三倍体24个:东兴金花茶(C.tunghinensis)、龙头山大树茶(C.longtousanica)、重庆山茶(C.chungkingensis)等、小长尾连蕊茶（C.parvicaudata Chang）等;四倍体共38个:怒江红山茶(C.saluenensis)、隐脉红山茶(C.cryptoneura)、秃苞红山茶(C.glabriperulata)、芙蓉红山茶(C.hilisciflora)、尖连蕊茶（C.cuspidata）等;六倍体35个:茶梅(C.sasanqua)、长尾红山茶(C.longicaudata)、寡瓣红山茶(C.paucipetala)等;八倍体5个:大花红山茶(C.Magniflora)、攸县油茶(C.yuhsienensis)、绵管红山茶（C.lanasituba）、阿斯特斯(Asitesi)、C.sasanqua‘297842’。
　　17个山茶属种质根尖压片、染色体计数结果如下:二倍体中:杜鹃红山茶核型公式为2n=2x=30=18sm+12m;南山茶核型公式为2n=2x=30=2sm+28m;浙江红山茶的核型公式为2n=2x=30=4sm+26m，3个山茶属种质核不对称系数分别为66.55％、59.73％和60.99％，核型分类均属于2A。越南抱茎茶核型公式为2n=2x=30=10sm+20m;红露珍核型公式为2n=2x=30=16sm+14m;金花茶核型公式为2n=2x=30=18sm+12m;白灵山红山茶核型公式为2n=2x=30=10sm+20m;耐冬山茶的核型公式为2n=2x=30=14sm+16m，5个山茶属种质核不对称系数分别为64.90％、63.60％、66.08％、63.18％、56.04％，核型分类均属于2B。多倍体中:‘斯威柯’核型公式为2n=3x=45=18m+27sm;小长尾连蕊茶核型公式为2n=3x=45=24m+18sm+3st; C.japonica‘297848’核型公式为2n=4x=60=40m+16sm+4st;芙蓉红山茶核型公式为2n=4x=60=32m+28sm;尖连蕊茶核型公式为2n=4x=60=40m+16sm+4st; C.japonica‘297851’核型公式为2n=6x=90=36m+54sm;C.japonica'297829’核型公式为2n=6x=90=54m+36sm;大花红山茶核型公式为2n=8x=120=64m+56sm;绵管红山茶核型公式为2n=8x=120=64m+40sm+16st，9个种质染色体核型不对称系数分别为64.03％、63.75％、61.98％、64.23％、60.45％、62.49％、61.49％、62.89％、62.95％,‘斯威柯’核型分类为3B型，C.japonica‘297851’核型为2A型，其它7个种质核型均为2B型。
　　山茶属植物倍性与形态指标相关分析表明，叶面积、节间长、气孔大小、叶长、叶宽、叶厚、叶柄长随倍性的增加而呈上升的趋势，叶长、叶宽、叶厚、叶柄长与倍性之间呈正相关;叶面积、节间长、气孔大小与倍性之间呈显著正相关;气孔密度与倍性之间呈显著负相关。花径、花瓣长度、花瓣宽度、花粉极轴长度、花粉赤道轴长度随倍性增加呈增加趋势，花粉的极轴长度、赤道轴长度与倍性呈显著正相关，花径、花瓣长度、花瓣宽度和花粉大小与倍性呈正相关。
　　大花红山茶、耐冬山茶开花时柱头与花药有一定空间距离，大花红山茶为雌蕊先熟，雄蕊后熟;杜鹃红山茶、耐冬山茶柱头与花药成熟时间无明显差别，二者柱头可授性和散粉时间有重叠。花粉/胚珠比、杂交指数以及授粉试验结果表明:杜鹃红山茶、耐冬山茶、大花红山茶不存在无融合生殖，三者均为以异交为主的混合交配系统，需要传粉者。大花红山茶具有延迟自交的花部特征。
　　大花红山茶花粉极面观呈正三角形，沟界极区较宽;花粉粒纹饰为穴状、小沟状雕饰纹;花粉粒平均极轴长为71.05μm，说明大花红山茶在山茶属中具有较为特殊的分类地位和系统进化地位。大花红山茶花粉萌发的适宜培养基为:150 g/L蔗糖+20 mg/L硼酸+100 mg/L KNO3+50 mg/L MgSO4+300 mg/L Ca(NO3)2，花粉萌发率可达68.10％。耐冬山茶花粉萌发的适宜培养基为:150 g/L蔗糖+0.05 g/L硼酸+100 mg/L GA3+900 g/LCa(NO3)2;杜鹃红山茶花粉萌发的适宜培养基为:200 g/L蔗糖+0.01 g/L硼酸+200 mg/LGA3+500 mg/L Ca(NO3)2。大花红山茶、耐冬山茶、杜鹃红山茶花粉最佳贮藏条件为-80℃，-80℃下贮藏360d后，萌发率仍可达到39.4％、36.7％、47.8％。3种保护酶活性高峰值前后花粉萌发率出现大幅度下降。3种保护酶活性对大花红山茶花粉萌发率的影响依次为:CAT＞SOD＞POD，3种保护酶活性对耐冬山茶、杜鹃红山茶花粉萌发率的影响依次为: SOD＞CAT＞POD。
　　杜鹃红山茶、耐冬山茶花粉染色体加倍的适宜方法为注射法，诱导大花粉秋水仙碱处理的适宜浓度为:3000 mg/L、5000 mg/L。小孢子母细胞减数分裂偶线期至终变期是杜鹃红山茶、耐冬山茶花粉加倍的适宜时期;秋水仙碱处理得到的杜鹃红山茶、耐冬山茶大花粉，体积、大小比对照花粉大，二者差异显著;激光扫描共聚焦显微镜检测大花粉和对照花粉DNA含量结果表明:大花粉粒DNA含量是对照单倍体花粉粒的二倍，二者存在统计学显著性，这表明2种山茶花粉染色体加倍处理得到的是二倍体花粉，即未减数2n花粉。
　　八倍体大花红山茶与二倍体杜鹃红山茶、耐冬山茶的种间杂交试验结果表明:花粉萌发率低、花粉萌发不整齐、花粉管生长缓慢是杜鹃红山茶×大花红山茶、耐冬山茶×大花红山茶杂交不育的主要原因。胚乳、珠被退化、解体坏死是大花红山茶×杜鹃红山茶、大花红山茶×耐冬山茶杂交不育的根本原因。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 前言

1．1．1 观赏植物种质资源性状变异研究

1．1．2 植物开花、繁育系统研究

1．1．3 植物花粉的生活力检测及贮藏技术研究

1．1．4 山茶花雌雄配子发生、发育与花芽外部特征关系研究

1．1．5 植物染色体加倍途径研究

1．1．6 植物杂交不育研究

1．1．7 研究的目的、意义

1．2 研究目标和主要研究内容

1．2．1 关键的科学问题与研究目标

1．2．2 主要研究内容

1．3 研究技术路线

第二章 山茶属种质倍性检测及核型分析

2．1 材料与方法

2．1．1 流式细胞仪检测山茶属种质倍性试验试剂及仪器

2．1．2 流式细胞仪检测山茶属种质倍性试验方法

2．1．3 流式细胞术数据分析

2．1．4 17个山茶属种质核型分析

2．2 结果与分析

2．2．1 流式细胞仪校准

2．2．2 流式细胞仪检测结果

2．2．3 不同预处理对染色体制片的影响

2．2．4 山茶属种质的核型分析

2．3 小结

第三章 山茶属种质倍性与形态学性状的相关性研究

3．1 材料与方法

3．1．1 试验材料

3．1．2 方法

3．1．3 数据处理及分析

3．2 结果与分析

3．2．1 山茶属种质叶长、叶宽、叶厚、叶柄长、叶面积与倍性的关系

3．2．2 山茶属种质节间长度与倍性的相关性

3．2．3 山茶属种质气孔与倍性相关性

3．2．4 花粉形状、大小与倍性的相关性

3．2．5 花粉外壁纹饰与倍性的相关性

3．2．6 花径与倍性的关系

3．2．7 花瓣大小、花瓣厚度、花瓣数目与倍性的相关性

3．3 小结

第四章 耐冬山茶、杜鹃红山茶及大花红山茶繁育生物学研究

4．1 材料与方法

4．1．1 耐冬山茶、杜鹃红山茶、大花红山茶柱头和花药空间位置变化

4．1．2 不同开花时间花粉生活力测定

4．1．3 耐冬山茶、杜鹃红山茶、大花红山茶柱头可授性测定

4．1．4 耐冬山茶、杜鹃红山茶、大花红山茶花粉／胚珠比的调查测定

4．1．5 耐冬山茶、杜鹃红山茶、大花红山茶杂交指数的计算

4．1．6 授粉实验

4．2 结果与分析

4．2．1 3种山茶花部特征

4．2．2 大花红山茶、杜鹃红山茶、耐冬山茶柱头、花药空间位置变化

4．2．3 不同开花阶段对大花红山茶、耐冬山茶及杜鹃红山茶花粉萌发率的影响

4．2．4 大花红山茶、耐冬山茶及杜鹃红山茶柱头可授性

4．2．5 大花红山茶、杜鹃红山茶、耐冬山茶花粉／胚珠比

4．2．6 杜鹃红山茶、耐冬山茶、大花红山茶的杂交指数

4．2．7 不同授粉方法对三种山茶结实率的影响

4．3．小结

第五章 三种山茶花粉贮藏条件及其活力的动态变化

5．1 材料与方法

5．1．1 试验材料

5．1．2 花粉形态扫描电镜观测

5．1．3 不同培养基对大花红山茶花粉萌发的影响

5．1．4 杜鹃红山茶、耐冬山茶花粉萌发培养基筛选

5．1．5 不同贮藏方法对大花红山茶山茶花粉萌发、保护酶活性的影响

5．1．6 不同贮藏方法对保护酶活性的影响试验

5．2 结果与分析

5．2．1 大花红山茶、杜鹃红山茶、耐冬山茶花粉表观形态

5．2．2 不同培养基对大花红山茶花粉萌发的影响

5．2．3 不同培养基对耐冬山茶花粉萌发的影响

5．2．4 不同培养基对杜鹃红山茶花粉萌发的影响

5．2．5 不同贮藏温度、贮藏时间下大花红山茶花粉萌发情况

5．2．6 不同贮藏温度、贮藏时间下耐冬山茶花粉萌发情况

5．2．7 不同贮藏温度、贮藏时间下杜鹃红山茶花粉萌发情况

5．2．8 不同贮藏温度与时间对大花红山茶花粉保护酶活性的影响

5．2．9 不同贮藏温度与时间对耐冬山茶花粉保护酶活性的影响

5．2．10 不同贮藏温度与时间对杜鹃红山茶花粉保护酶活性的影响

5．2．11 大花红山茶花粉萌发率与3种保护酶活性的相关性

5．2．12 杜鹃红山茶、耐冬山茶萌发率与3种保护酶活性的相关性

5．3 小结

第六章 杜鹃红山茶、耐冬山茶花粉染色体加倍研究

6．1 材料与方法

6．1．1 试验材料

6．1．2 杜鹃红山茶、耐冬山茶花芽形态特征与花粉发育进程的关系研究

6．1．3 秋水仙碱处理对杜鹃红山茶、耐冬山茶花粉染色体加倍的影响

6．1．4 小孢子不同发育阶段秋水仙碱注射处理对大花粉诱导率的影响

6．1．5 正常花粉与大花粉的统计与鉴定

6．1．6 2n花粉粒的纯化与授粉杂交

6．2 结果与分析

6．2．1 杜鹃红山茶花芽形态特征与小孢子母细胞减数分裂的相关关系

6．2．2 耐冬山茶花芽形态特征与小孢子母细胞减数分裂的相关关系

6．2．3 不同秋水仙碱处理方法、处理浓度对大花粉诱导的影响

6．2．4 小孢子不同发育阶段秋水仙碱注射处理对大花粉诱导率的影响

6．2．5 秋水仙碱处理次数对二种山茶大花粉诱导率、花粉量的影响

6．2．6 2n花粉粒鉴定

6．2．7 授粉杂交结果

6．3 小结

第七章 不同倍性山茶物种正反交的育性研究

7．1 材料与方法

7．1．1 试验材料来源

7．1．2 花粉收集、授粉及试验材料处理

7．1．3 花粉在柱头上萌发及花粉管生长的观测

7．1．4 切片观察

7．2 结果与分析

7．2．1 人工授粉时间的确定

7．2．2 大花红山茶异株自交及其与杜鹃红山茶、耐冬山茶杂交花粉萌发及花粉管生长

7．2．3 杜鹃红山茶、耐冬山茶异株自交及其与大花红山茶杂交花粉萌发及花粉管生长

7．2．4 大花红山茶×杜鹃红山茶、耐冬山茶正反交花粉管进入胚珠率

7．2．5 大花红山茶×杜鹃红山茶、耐冬山茶正反交膨大胚珠率与结籽率

7．2．6 大花红山茶×杜鹃红山茶、耐冬山茶正反交胚胎发育观察

7．3 小结

第八章 结论与讨论

8．1 结论

8．2 讨论

8．2．1 山茶属种质倍性检测

8．2．2 山茶属种质叶、节间长与倍性、种类等的关系

8．2．3 山茶属种质叶片气孔与倍性的关系

8．2．4 山茶属种质花粉与倍性的关系

8．2．5 山茶属种质花与倍性、种类的关系

8．2．6 大花红山茶、耐冬山茶、杜鹃红山茶繁育生物学研究

8．2．7 大花红山茶的延迟自交机制和杜鹃红山茶濒危原因探讨

8．2．8 大花红山茶花粉表观形态

8．2．9 培养基、贮藏方法对花粉萌发的影响

8．2．10 耐冬山茶、杜鹃红山茶、大花红山茶花粉萌发率与保护酶活性

8．2．11 花芽形态特征与花粉母细胞减数分裂

8．2．12 处理时期对诱导大花粉的影响

8．2．13 处理方法对诱导杜鹃红山茶、耐冬山茶大花粉的影响

8．2．14 适宜的秋水仙碱处理浓度、处理次数

8．2．15 体积、激光扫描共聚焦显微镜法鉴定2n花粉

8．2．16 杜鹃红山茶、耐冬山茶2n花粉诱导的可行性

8．2．17 不同倍性山茶物种正反交的育性研究

8．3 主要创新点

8．4 展望

参考文献

在读期间的学术研究

致谢