SABP2和SAMT基因在杨树与溃疡病菌(Botryosphaeria dothidea)互作中的功能分析

摘要

一年生草本植物受到病原菌侵染时，体内的水杨酸甲基转移酶(salicylic acid methyltransferase，SAMT)基因能将植物侵染部位产生的水杨酸(salicylicacid，SA)转化为水杨酸甲酯(methyl salicylate，MeSA)，部分MeSA挥发到空气中，在植物的未侵染部位通过水杨酸结合蛋白2（salicylic acid-binding protein2，SABP2）再次转化为SA，这一过程在SA信号转导和植物系统获得抗性(systemic acquired resistance，SAR)中起着重要作用。而多年生木本植物中SAMT和SABP2基因的功能还有待进一步验证。 本研究对SABP2和SAMT基因在杨树与溃疡病菌（Botryosphaeria dothidea）互作中的功能进行了研究，首先对该两个基因进行了克隆和遗传转化，并对转基因苗木抗性进行了接种验证分析，结果如下: 84K杨SABP2基因ORF全长cDNA序列789bp，编码263个氨基酸。序列分析和比对显示84K杨SABP2基因与其他植物的相关序列同源性高达76％～98％。比对结果一定程度上也体现了SABP2在结构上的保守性。用生物信息学相关软件对其蛋白质功能进行预测，显示其可能具有中间代谢功能，属于α/β折叠水解酶家庭成员中的酯酶。 84K杨SAMT基因的cDNA序列全长1095bp，开放阅读框1094bp，编码364个氨基酸;对该基因编码的蛋白的理化性质、疏水性、结构域、功能、二级结构及亚细胞定位等进行了生物信息学分析，结果显示:该基因位于细胞质中，属于甲基转移酶7家族，为亲水性蛋白。 利用Gateway克隆技术，成功构建了SABP2和SAMT的超表达和RNAi载体，通过农杆菌介导的“叶盘转化法”获得了各自的转基因苗木，SABP2和SAMT超表达株系分别命名为OE-SABP2和OE-SAMT，SABP2和SAMT沉默株系分别命名为R-SABP2和R-SAMT，挑选合适的株系进行接种试验。 接种结果表明:SAMT在杨树中与SA和MeSA密切相关，在接种部位和未接种部位均可以将SA转化为MeSA。OE-SAMT植株在接种病原菌B.dothidea后，接种期内，组织中SAMT和MeSA的变化趋势保持一致，接种后转基因植株与野生型相比组织中的MeSA含量和气化的MeSA均呈显著或极显著上升，同时SA含量显著降低;而R-SAMT植株则在接种后显著降低了植株组织中的MeSA含量，同时挥发到空气中的MeSA降低。 SABP2在杨树中与SA和MeSA的关系同样密切相关，能在接种部位和未接种部位将MeSA转化为SA。OE-SABP2植株接种期间与野生型相比，接种部位组织中SA含量上升，而且接种期内各时间段挥发的MeSA和组织中的MeSA含量与野生型相比均显著或极显著下降，与前人研究认为SABP2能催化MeSA合成SA相一致。OE-SABP2杨树中MeSA的降低应是受SABP2的催化部分形成SA所致。OE-SABP2未接种部位MeSA与野生型相比显著降低，但SA的含量也显著降低，是由于接种部位挥发的MeSA较少，相应地在未接种部位转化的SA也较少有关。R-SABP2在接种后期SA的含量和野生型相比也显著降低。 PR-1在杨树中不能作为获得SAR的标志，杨树中植株的抗病和感病和SA的含量关系更为密切。各株系在接种结束后，与对照相比，OE-SABP2植株接种结束后显示比野生型抗病与植株中存在SA的含量最高有关;OE-SAMT植株接种结束后没有野生型抗病是由于该植株中SAMT的高表达带动了PR-1的高表达，而PR-1高表达的植株一般更易感病，且PR-1是否抗病和病原菌的种类有关。R-SAMT植株和R-SABP2植株与野生型相比也更易感病，也与接种后PR-1大量上调表达有关。 转基因植株在遗传转化过程中存在将某个基因超量表达或干扰后，引起其他基因表达改变的情况，试验中在OE-SAMT植株中更显著，SAMT在植株中的超量表达，接种前就使得PR-1响应SAMT的表达而大量上调表达，接种后也发现SAMT的大量上调表达带动了SABP2的大量上调表达。对试验中测定的相关基因的影响使得接种结束OE-SAMT植株变得比野生型更易感病，可能也与自身其他基因的改变有关。 转基因植株中未发现SAMT和SABP2存在平衡制约关系，与前人推测接种后SAMT的高表达是由于接种点SA的升高对植株的毒害作用，需要通过SAMT将其中的一部分转化为MeSA从而挥发到空气中相矛盾。 研究表明，接种后SAMT和SABP2基因的表达在杨树中和MeSA和SA的生物合成相关，接种B.dothidea后SAMT的超表达植株能显著提高挥发到空气中的MeSA和组织中MeSA的含量，同时降低SA在组织中的含量;而对其进行RNAi后则降低MeSA的合成，OE-SABP2也显著降低了MeSA的合成，提高了组织中SA的含量，植株抗病性提高。

目录

声明

摘要

第一章绪论

1．1引言

1．1．1研究背景

1．1．2国内外研究现状及评述

1．2研究目标和主要研究内容

1．2．1研究关键的科学问题

1．2．2主要研究内容

1．3研究技术路线

1．4研究的项目来源和经费支持

第二章SABP2和SAMT基因的克隆及功能分析预测

2．1试验材料与研究方法

2．1．1试验材料

2．1．2试验方法

2．2结果与分析

2．2．1试验结果

2．2．2试验分析

2．3讨论

2．4小结

第三章SABP2和SAMT基因超表达和RNA干扰载体的构建

3．1试验材料与研究方法

3．1．1试验材料

3．1．2试验方法

3．2结果与分析

3．2．1试验结果

3．2．2试验分析

3．3小结

第四章SABP2和SAMT基因的遗传转化及在各组织中的特异性表达

4．1试验材料与研究方法

4．1．1试验材料

4．1．2试验方法

4．2试验结果与分析

4．2．1试验结果

4．2．2试验分析

4．3小结

第五章SABP2和SAMT基因对Botryosphaeria dothidea的抗性分析

5．1试验材料与研究方法

5．1．1试验材料

5．1．2试验方法

5．2试验结果与分析

5．2．1试验结果

5．2．2试验分析

5．3小结

第六章结论与讨论

6．1结论

6．2讨论

6．2．2SABP2在杨树与溃疡病菌(B．dothidea)互作中的功能

6．3展望

参考文献

在读期间的学术研究

致谢