馒头柳镉吸收转运的分子生理学基础研究

摘要

人类活动和工业的发展导致土壤Cd污染日益严重。Cd是植物生长非必需元素，其化合物溶解度高，在土壤——植物系统中具有很强的迁移能力。植物修复是利用植物将重金属污染物从土壤中清除，或使之无害，具有费用低廉、安全有效、原位修复、可持续发展等特征。木本植物具有生物量大、生长迅速、根系拓展的深度和范围广、能有效地将重金属转运至地上部等优势，是重金属污染土壤修复的优良候选材料。本研究以旱柳的栽培变型馒头柳为研究对象，旱柳为对照，探索二者在Cd胁迫后的形态、生理生化和分子方面的差异，随后通过转录组测序技术从分子层面挖掘Cd吸收、转运、解毒等过程相关的基因，进而解析分子调控机制。主要研究结果如下: 1.从分子系统进化方面证实了馒头柳和旱柳分类学上的亲缘关系，二者叶绿体基因matK和核糖体基因ITS同源性高达99％以上。100μmol L-1CdCl2胁迫后，馒头柳和旱柳在植物生长、根系形态、叶绿素含量、光合作用等方面都表现出一定的差异。 2.馒头柳和旱柳在地上部Cd积累方面存在显著差异，同一胁迫时间点馒头柳相同组织中的Cd含量高于旱柳，且随胁迫时间的延长差异越显著。胁迫1天后，在馒头柳根尖有较强的Cd2+流入，并且其空间动态变化趋势同旱柳基本一致，但馒头柳同一根尖位置吸收量高于旱柳，并随胁迫时间的延长而递增。双硫腙组化染色定位发现馒头柳在根、茎、叶及主脉中积累了大量的Cd-双硫腙复合物，同位置积累复合物明显多于旱柳。透射电镜和EDX能谱观测证实Cd主要积累在液泡内、细胞壁和细胞间隙。Cd胁迫下，馒头柳、旱柳的根系、树皮、木质部和叶片FTIR特征图谱存在不同程度的差异，是由于与Cd发生离子交换、络合、转运的基团、载体或大分子物质存在不同，而馒头柳的根、皮、木质部和叶片能通过羟基、羧基等官能团的结合来缓解Cd积累所造成的毒害。以上结果表明，馒头柳具有相对较强的Cd吸收、转运和积累能力，是优良的植物修复候选材料。 3.Cd胁迫后，馒头柳和早柳体内膜质过氧化水平和活性氧自由基(ROS)含量随胁迫时间的延长而增加。根系活力、抗氧化酶、非酶类抗氧化物等表现出了时间、组织的特异性。综合对比各项生理指标，馒头柳具备更强的适应能力和抗氧化胁迫能力。植物内源激素参与了重金属胁迫响应等许多生理过程的调节，本研究中，生长素、脱落酸、茉莉酸和水杨酸在响应Cd胁迫后都发生了变化，其中茉莉酸显著升高且趋势明显，可能在响应Cd胁迫方面起到重要的作用。 4.利用Illumina HiSeqTM2500测序平台对Cd胁迫后不同时间的两种柳树根系进行转录组测序。经过测序质控共得到高质量的152.46Gb Clean Data，随后组装、拼接共得到76194条Unigenes，N50为1427bp。通过对比不同胁迫时间馒头柳和旱柳根系内差异基因数量变化，发现Cd胁迫初期，馒头柳中响应的差异基因数量虽少于旱柳，但后期参与的基因数量显著高于旱柳。差异基因在馒头柳、旱柳中的瞬时表达模式及其GO注释分类存在明显差异，馒头柳根系中有更多的基因参与了Cd的转运、解毒等生物学过程。通过对Cd转运、解毒、信号传导等相关的12个基因q-PCR分析，结果表明这些基因在馒头柳根中的表达量显著高于旱柳，初步证实ABC转运因子(ATP-binding cassette transponer,ABC)、bZIP转运因子(bZIP transcription factor family,bZIP)、金属硫蛋白(Metallothionein,MT)、植物螯合肽合成酶(Phytochelatin syntheses，PCS)、金属转运因子（Natural resistance-associated macrophage protein，Nramp）等基因在馒头柳根系中起到了重要的作用，也为进一步探索其功能提供了依据。 5.基于转录组测序数据，通过5种运算统计方法对馒头柳11个候选内参基因在干旱、盐、重金属3种非生物胁迫及6个不同组织器官中的表达稳定性分析，筛选出2个表达最稳定的内参基因a-TUB2和DnaJ。利用功能基因SmCAT检测了这两个内参基因的稳定性，证明a-TUB2和DnaJ在馒头柳11个候选内参基因中是最稳定、可靠的内参基因。本研究中内参基因的筛选将促进柳属植物在各类非生物胁迫下相关基因的表达分析和比较。

目录

声明

摘要

第一章绪论

1．1．1研究背景

1．1．2植物修复技术

1．1．3木本植物对Cd的吸收、转运

1．1．4植物对Cd解毒的生理分子机制

1．2研究目标和主要研究内容

1．2．1关键的科学问题与研究目标

1．2．2主要研究内容

1．3研究技术路线

第二章馒头柳和旱柳同源性分析及Cd耐受性差异研究

2．1材料与方法

2．1．1实验材料及培养

2．1．2菌株及载体

2．1．3酶及试剂

2．1．4培养基、试剂和缓冲液的配置

2．1．5主要仪器设备

2．1．6实验设计

2．1．7方法

2．1．8数据处理

2．2结果与分析

2．2．1馒头柳、旱柳同源性分析

2．2．2 Cd胁迫对馒头柳、旱柳生长的影响

2．2．3 Cd胁迫对馒头柳、旱柳光合作用的影响

2．2．4 Cd胁迫对馒头柳、旱柳根系形态的影响

2．2．5 Cd胁迫对馒头柳、旱柳不同组织中镉积累量的影响

2．3讨论

2．4小结

第三章两种柳树对Cd的吸收及其分布特征研究

3．1材料与方法

3．1．1实验材料及培养

3．1．2试剂

3．1．3主要仪器设备

3．1．4实验设计

3．1．5方法

3．2结果与分析

3．2．1 Cd在组织和亚细胞水平定位

3．2．2根中Cd2+的净流速分析

3．2．3红外光谱表征解析

3．3讨论

3．3．1 Cd积累、分布及解毒的显微调控机制

3．3．2根系Cd2+时空变化

3．3．3不同组织器官的红外光谱定性分析

3．4小结

第四章两种柳树对Cd胁迫的生理响应

4．1材料与方法

4．1．1实验材料及培养

4．1．2试剂

4．1．3主要仪器设备

4．1．4实验设计

4．1．5方法

4．2结果与分析

4．2．1电导率

4．2．2根系活力

4．2．3 ROS含量

4．2．4抗氧化酶活性

4．2．5非酶类抗氧化物含量

4．2．6内源激素含量

4．3讨论

4．4小结

第五章两种柳树Cd胁迫后基因表达差异分析

5．1材料与方法

5．1．1实验材料及培养

5．1．2试剂

5．1．3主要仪器设备

5．1．4实验设计

5．1．5方法

5．1．6生物信息学分析

5．1．7功能基因验证

5．2结果与分析

5．2．1转录组数据组装

5．2．2功能注释

5．2．3 Cd胁迫响应差异表达基因分析

5．2．4差异基因表达模式分析

5．3讨论

5．4小结

第六章非生物胁迫下馒头柳内参基因筛选

6．1材料与方法

6．1．1实验材料及培养

6．1．2试剂

6．1．3主要仪器设备

6．1．4实验设计

6．1．5方法

6．2结果与分析

6．2．1候选内参基因的引物特异性、扩增效率分析

6．2．2候选内参基因表达丰度分析

6．2．3候选内参基因稳定性分析

5．2．4内参基因稳定性验证

6．3讨论

6．4小结

第七章结论与展望

7．1结论

7．1．1 Cd胁迫对馒头柳生长、形态、积累的影响

7．1．2 Cd胁迫对馒头柳吸收、分布及吸附固定的影响

7．1．3 Cd胁迫对馒头柳抗氧化系统及内源激素的影响

7．1．4 Cd胁迫下馒头柳转录组表达差异分析

7．1．5非生物胁迫下馒头柳内参基因筛选

7．2创新点

7．3展望

参考文献

附录

在读期间的学术研究

致谢