雪莲细胞培养物中黄酮类物质代谢调控及其生物活性成份分析

摘要

水母雪莲(Saussurea medusa Maxim.)和新疆雪莲(Saussurea involucrata Karel.et Kir.)是我国珍稀的药用植物资源，具有清热解毒、止痉镇痛、敛伤、消肿及治疗热病、风湿等多种功效。雪莲的主要药用成份为紫丁香甙(Syrmgin)、芦丁(Rutin)、高车前素(Hispidulin)和Jaceosidin等苯基丙酸类(phenylpropanoid)和黄酮类(flavonoids)物质。最新的药理研究表明，上述物质还具有抗菌消炎、保肝降压、延缓衰老和抑制癌细胞增殖等重要的研发价值。
　　 雪莲生境恶劣，生长缓慢，人工引种困难，加上长期掠夺性采挖，已使雪莲处于灭绝的边缘。为了保存国家珍稀植物品种，保护生态环境，满足临床上对雪莲药物的需求，本研究在雪莲组织培养的基础上，应用诱导子添加技术和毛状根培养技术对雪莲中具有重要药用价值的次生代谢物质进行调控，并对雪莲MYB类转录因子的功能进行了初步探索，为保护珍稀植物资源、维护生态环境、开发野生雪莲替代产品、缩短雪莲药用成份的生产周期奠定了基础。另外，分析了野生雪莲和雪莲培养物中主要生物活性成份的种类及含量，为今后雪莲药理药效研究及品质评价奠定了基础。
　　 为了提高雪莲黄酮的产量，满足工业化生产的需要，在细胞培养水平上，通过添加茉莉酸甲酯(MJ)，对雪莲黄酮类物质的代谢进行调控。研究了诱导子的添加时间、添加浓度对水母雪莲红色系悬浮细胞的生物量和总黄酮产量的影响。发现在细胞培养的指数期(第9天)添加5.0μmol/L的MJ，可以使总黄酮产量提高2.4倍(1134.5±63.86mg/L)，而雪莲细胞干重(dw)仅比对照提高23.8％(20.4±0.27 g/L)。另外，细胞中苯丙氨酸裂解酶(PAL)的活性分析表明，MJ添加后PAL活性的增加与雪莲总黄酮含量增长之间存在相关性。
　　 在器官培养水平上，对雪莲毛状根的诱导频率及其培养条件进行了研究。结果表明，选择发根农杆菌R1601侵染预培养2天的新疆雪莲根段外植体，毛状根的诱导效率可达到83％。毛状根的冠瘿碱检测、PCR和Southern分析表明，Ri质粒中的T-DNA已整合到植物基因组中并稳定表达。以新疆雪莲毛状根为外植体，能够容易地获得再生芽。在含有1.0 mg/L6-BA的MS固体培养基上，其再生频率高达91±5.9％，是其正常根的2.4倍。而水母雪莲在该培养条件下，仅有少量的畸形芽出现。进而对毛状根的培养条件进行初步研究，结果表明在无激素附加的MS液体培养基中，新疆雪莲的HR1601根系在一个培养周期内(32天)，其生物量能够达到接种量的16倍，而紫丁香甙含量(43.5±1.13 mg/g dw)能够达到野生雪莲的83倍。从而显示了雪莲毛状根培养体系的优良特性。
　　 在基因水平上，对雪莲黄酮类物质代谢调控的研究已经展开。玉米P基因编码的Myb类转录因子能够调节黄酮类物质代谢途径关键酶基因的表达。根据P基因的保守序列设计引物，从雪莲细胞培养物中获得了SmP基因。核酸序列分析表明，Smp基因与烟草中涉及苯丙素类物质代谢途径的LBM1、LBM3和MybAS1基因具有较高的一致性，分别为66％、60％和61％。因此为了研究雪莲Smp基因的功能，构建了正义表达载体，并与先前构建好的反义表达载体分别导入烟草，分析了转基因植株的形态特征及黄酮类物质的含量变化。其中，约有30％转反义Smp基因的株系表现叶片皱缩、叶脉紊乱、主侧脉角度缩小、叶片、花瓣失去对称性以及花粉败育等性状。
　　 另外，通过正交试验设计优化了雪莲提取工艺的条件，并对雪莲细胞提取物进行了分离纯化。正交试验设计结果表明，温度对雪莲黄酮提取效率的影响极为显著，而分批多次提取比一次性浸提，能够收到较好的提取效果。考虑到工业生产中的实际问题，推荐在60℃水浴条件下，采用50％乙醇对雪莲样品连续浸提2次的方案。对雪莲提取物的纯化研究表明，雪莲成份复杂，仅依靠单一的分离手段，往往难以奏效。另外，野生雪莲及雪莲培养物中生物活性成份的比色法、HPLC(High Performance Liquid Chromatography)、LC-ESI-MS(Liquid ChromotagraphyElectrospray Ionization Mass Spectrometry)分析表明，传统的NaNO2-AlCl3法测定雪莲总黄酮的含量，结果偏高，不利于雪莲黄酮的实验室研究分析与今后工业化生产的质量监控。而AlCl3法的显色反应较为特异，今后有望取代NaNO2-AlCl3法，作为雪莲类药材品质评价的标准。而HPLC-DAD结合LC-ESI-MS可以对雪莲中的主要生物活性成份进行较为准确的定性分析，从而解决了由于缺乏相应的雪莲化合物标准品而难以对雪莲中的成份进行定性定量分析及比较的难题。最后综合利用上述分析方法，对雪莲细胞培养物中的花素类物质进行了分析。结果表明，雪莲细胞中至少含有7种花色素类物质，分别为矢车菊素-3-O-葡萄糖甙及其衍生物、天竺葵素糖甙衍生物和芍药色素糖甙衍生物。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章 前言

1.1植物次生代谢调控及其细胞培养工程研究进展

1.1.1植物次生代谢调控

1.1.2植物细胞培养工程

1.2细胞培养技术在雪莲中的应用

1.2.1雪莲研究概况

1.2.2雪莲细胞培养工程的研究进展

1.3雪莲中化学成份的分析技术

1.3.1雪莲的定量分析

1.3.2雪莲的定性分析

1.4本研究的意义及拟采取的方案

1.4.1研究背景

1.4.2研究目的和意义

1.4.3研究内容及方案

第二章 诱导子技术在雪莲细胞培养中的应用

2.1引言

2.2实验材料和方法

2.2.1实验材料和仪器试剂

2.2.2实验方法

2.3结果与分析

2.3.1水母雪莲细胞生长与黄酮积累的动态变化

2.3.2 MJ对水母雪莲悬浮细胞生长状态的影响

2.3.3 MJ对水母雪莲悬浮细胞黄酮产量的影响

2.3.4 MJ处理后细胞的生长和黄酮含量变化动态

2.3.5 MJ对PAL活性的影响

2.4讨论

第三章 毛状根培养技术在雪莲中的应用

3.1引言

3.2实验材料和方法

3.2.1实验材料和仪器试剂

3.2.2实验方法

3.3结果与分析

3.3.1新疆雪莲毛状根的诱导

3.3.2新疆雪莲毛状根的筛选

3.3.3毛状根再生苗的获得

3.3.4毛状根及其再生植株的PCR与Southern Blot分析

3.3.5毛状根及其再生植株中甘露碱的纸层析分析

3.3.6毛状根中黄酮和紫丁香甙含量的分析

3.3.7毛状根接种量、接种部位的选择

3.3.8毛状根生长曲线和基本培养基筛选

3.4讨论

第四章 雪莲SmP基因在烟草中的功能分析

4.1引言

4.2实验材料和方法

4.2.1实验材料和仪器试剂

4.2.2实验方法

4.3结果与分析

4.3.1 SmP基因生物信息学分析

4.3.2水母雪莲SmP基因正义表达载体的构建

4.3.3烟草遗传转化及转基因烟草的表型分析

4.3.4转基因烟草的分子生物学鉴定

4.3.5转基因烟草中黄酮类化合物的分析

4.4讨论

第五章 雪莲中生物活性成份的提取、分离与分析

5.1引言

5.2实验材料和方法

5.2.1实验材料和仪器试剂

5.2.2实验方法

5.3结果与分析

5.3.1雪莲中黄酮类物质的提取工艺优化

5.3.2雪莲中黄酮类物质的分离与纯化

5.3.3雪莲中生物活性成份的定量分析

5.3.4雪莲中生物活性成份的定性分析

5.3.5水母雪莲细胞培养物中花色素的分析

5.4讨论

第六章 结论

参考文献

致谢

个人简历