诱导子对水母雪莲次生代谢的影响及雪莲查耳酮合成酶基因克隆

摘要

水母雪莲(Saussurea medusa Maxim)为菊科凤毛菊属植物，是名贵中药材。为解决雪莲资源匮乏，我们实验室通过植物组织培养技术，成功的建立起水母雪莲细胞和毛状根体系。通过对它的药理实验及化学成分分析，主要成分为黄酮类物质和紫丁香甙单体。为了进一步提高这些物质在水母雪莲培养物中的含量，本文开展通过添加外源诱导子手段来调控水母雪莲次生代谢合成途径。
　　 利用水杨酸(SA)和酵母提取物(YE)作为外源诱导子，添加到水母雪莲细胞系和毛状根系培养基中，研究诱导子不同添加浓度和不同添加时间对水母莲细胞系和毛状根系的生长及次生物质合成的诱导效应。实验结果发现：对于细胞系来说，SA比YE的诱导效果要好，低浓度SA处理时，不仅能促进细胞的生长，还能提高水母雪莲细胞中黄酮化合物和紫丁香甙的含量。其中，在细胞生长周期的第6天添加终浓度为20μM的SA，诱导效果表现最佳。在此条件下，细胞内总黄酮产量达到532 mg/l，紫丁香甙为630 mg/l，分别比对照提高了130％，和150％。对于毛状根体系来说，SA和YE生长早期添加会抑制毛状根生长。总体上，YE的诱导效果比SA明显。在第10天添加终浓度为40μg/ml的YE，总黄酮达到741 mg/l，紫丁香甙达到303 mg/l，分别是对照的2.8和2.5倍。
　　 同时研究了20μM和100μM SA诱导下，黄酮合成途径中相关酶的变化。发现，低浓度的SA能在短时间内诱导CHS和CHI表达，24h后PAL酶活性升高到对照的7.5倍，而48 h总黄酮的含量检测到最高值。因此可以初步断定，SA诱导苯基苯丙烷类物质的积累与CHS和CHI表达，PAL酶活性提高有关。
　　 另外，从水母雪莲cDNA中克隆到雪莲黄酮合成途径的第一个关键酶—查耳酮合成酶基因(SmCHS)全长cDNA。此cDNA序列全长为1313bp，其编码的蛋白为389个氨基酸，推测的氨基酸序列与许多物种都高度同源，同源性高达88％。生物信息学分析，SmCHS具有CHS-like保守结构域，其二级结构与苜蓿的CHS十分相似，且苜蓿中的CHS酶活性中心的关键氨基酸位点在SmCHS也一致对应相同，没有突变。因此可以初步推测这个SmCHS应该具有查耳酮合成酶功能。并进一步构建SmCHS植物表达载体，转化拟南芥chs突变体，通过功能互补分析研究此基因的功能。由于时间关系这部分研究尚在进行中，还未完成。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩写词

前言

第一节植物次生代谢

1.植物次生代谢研究状况

第二节雪莲研究

1雪莲简介

2雪莲的药理

3雪莲的化学成分研究

4雪莲目前研究进展

5本实验室在提高水母雪莲细胞黄酮产量方面所做的研究

第二章诱导子对水母雪莲培养物的生长及次生代谢产物合成影响

第一节引言

第二节材料与方法

1实验材料与试剂

2实验方法

第三节实验结果与分析

1.水母雪莲培养物与野生植株黄酮和紫丁香甙含量对比

2.细胞系

3.水母雪莲毛状根系

4. SA和YE对水母雪莲悬浮细胞系和毛状根诱导效果的比较

5. SA诱导下CHS、CHI基因表达量、PAL酶活性与黄酮含量的关系

6.讨论

7.小结

8.下一步工作

第三章水母雪莲查耳酮合成酶(SmCHS)基因克隆

总结与展望

参考文献

附 录

致 谢

个人简历及硕士期间研究成果