抗肿瘤新药—豹蛙酶在大肠杆菌中的克隆表达及分离纯化

摘要

豹蛙酶(Onconase)是一种能够有效地抑制人白血病细胞和人腺癌细胞生长的核糖核酸酶，尤其对恶性间皮瘤疗效显著，目前已进入Ⅲ期临床研究阶段。本实验采用基因工程方法使豹蛙酶在大肠杆菌中得到高效表达，并研究其分离纯化工艺，得到生物活性较好的重组豹蛙酶蛋白。
　　 设计重组豹蛙酶的结构，在天然豹蛙酶序列前端添加肠激酶酶切位点，根据其氨基酸序列，采用大肠杆菌偏爱密码子设计合成8段引物，采用重叠延伸PCR法合成出目的基因，约350bp。将得到的片断克隆于载体pGEM-T中并测序，再连接至表达载体pET-22b(+)中，重组质粒转入大肠杆菌Rosettatm(DE3)中。转化的重组大肠杆菌以IPTG诱导外源基因表达，采用Tricine-SDS-PAGE系统，分析目标蛋白主要以包涵体形式存在。温度为37℃时，pH为7.0，以物质的量浓度为0.5mmol/L的IPTG诱导4h，目的基因在大肠杆菌中的表达最佳，其质量分数可达48.8％。利用液相电喷雾串联质谱方式(LC-ESI-MS/MS)鉴定蛋白，通过LCQ DECA XP Plus系统进行蛋白序列的分析，其覆盖率达到35％，确定了其蛋白质一级结构的正确性。
　　 通过对重组豹蛙酶的表达模式的研究，进一步确定其分离纯化工艺。包涵体经洗涤、变性、复性，使用肠激酶将融合蛋白部分切除，再采用SPFF强阳离子交换层析纯化，硫酸铵沉淀浓缩后，再通过Sephadex G-25分子筛收集活性组分，得到了纯度97.5％的豹蛙酶蛋白，发酵总产量达255mg/L，并具有较明显的体外核糖核酸降解活性。

目录

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第一章 绪论

1.1豹蛙酶的研究现状

1.1.1豹蛙酶化学结构和稳定性

1.1.2豹蛙酶抗肿瘤作用机制

1.1.3豹蛙酶与其它药物的协同作用、免疫调节和抗病毒作用

1.2豹蛙酶的生产方法

1.2.1天然提取法

1.2.2基因工程方法

1.3重组质粒的构建

1.3.1载体的选择

1.3.2目标片段的克隆

1.4大肠杆菌表达系统简介

1.4.1以大肠杆菌为宿主基因表达的策略

1.4.2重组蛋白在大肠杆菌中表达的影响因素

1.4.3选择宿主和控制培养条件

1.4.4重组蛋白在大肠杆菌中的表达模式

1.5重组蛋白的分离纯化技术

1.5.1层析方法的选择

1.5.2离子交换层析

1.5.3凝胶过滤层析

1.5.4其他方法

第二章 豹蛙酶基因的克隆

2.1引言

2.2实验材料与仪器

2.2.1实验材料

2.2.2实验仪器

2.3实验方法

2.3.1引物设计及合成

2.3.2 PCR扩增

2.3.3 PCR产物回收(试剂盒)

2.3.4连接

2.3.5感受态细胞的制备(氯化钙法)

2.3.6转化

2.3.7质粒提取(碱裂解法)

2.3.8酶切鉴定

2.3.9基因测序鉴定

2.3.10表达载体pET-22b-onconase的构建

2.4结果分析与讨论

2.4.1 PCR产物琼脂糖凝胶电泳

2.4.2 PCR鉴定

2.4.3测序鉴定

2.4.4表达载体pET-22b-onconase的构建

2.5本章小结

第三章 重组豹蛙酶基因工程菌培养条件的优化

3.1引言

3.2试验材料与仪器

3.2.1试验材料

3.2.2实验仪器

3.3实验方法

3.3.1菌种活化

3.3.2菌种培养

3.3.3不同菌种的选择

3.4发酵过程各因素的影响

3.4.1培养时间

3.4.2诱导条件

3.5分析方法

3.5.1菌体浓度的测定

3.5.2 SDS-PAGE分析目标蛋白表达量

3.6结果与讨论

3.6.1不同菌种融合蛋白表达分析

3.6.2基因工程菌的生长

3.6.3不同诱导条件对融合蛋白表达量的影响

3.7小结

第四章 重组豹蛙酶的分离纯化

4.1引言

4.2实验材料和仪器

4.2.1实验材料

4.2.2实验仪器

4.3实验方法

4.3.1重组豹蛙酶在大肠杆菌Rosetta(DE3)内的分布

4.3.2重组豹蛙酶的分离纯化

4.3.3 LC-ESI-MS/MS鉴定豹蛙酶

4.4分析方法

4.4.1 SDS-PAGE凝胶电泳

4.4.2蛋白浓度的测定

4.4.3豹蛙酶活性的测定

4.5结果与分析

4.5.1重组豹蛙酶在菌体中的分布

4.3.2重组豹蛙酶的分离纯化

4.3.3重组豹蛙酶的活性鉴定

4.3.4 LC-ESI-MS/MS鉴定豹蛙酶

4.6小结

第五章 结论与建议

5.1结论

5.2建议

参考文献

附录

致谢

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