重要生物标志物--甲胎蛋白、瘦素及肌钙蛋白I的绝对定量方法

摘要

甲胎蛋白(AFP)、瘦素(LEP)和肌钙蛋白Ⅰ(cTnⅠ)是人体细胞分泌的三种重要蛋白，参与着人体许多重要生理机能的调节，人体的健康情况与其含量的变化密切相关。经过大量研究，三者已被确定为重要的生物标志物，在临床检验方面有着广泛的应用。目前常用的甲胎蛋白、瘦素和肌钙蛋白Ⅰ的检测方法是采用免疫分析法，如酶联免疫分析法(ELISA)、化学发光免疫分析法(CLIA)及放射免疫分析法(RIA)等。但免疫分析法普遍存在耗时长，费用昂贵、操作繁琐且检测结果无跨时空的可比性等缺点，使其在临床实际应用中受到了极大的限制。为满足临床检验的需求，确保测量结果准确可比和可溯源性，并实现临床检验的标准化，亟需建立蛋白质标准定量参考方法，研制出相关的标准物质。 由于同位素稀释质谱法具有测量动态范围宽、灵敏度高、可实现绝对测量且测量结果可直接溯源至国际基本单位制等特点，近年来成为国内外实验室广泛使用的蛋白准确定量方法，并被确认为蛋白质标准物质定值的基准方法。然而，目前利用同位素稀释质谱法准确定量检测人源甲胎蛋白、人源瘦素和重组肌钙蛋白Ⅰ的研究还未有报道。 本文主要利用高效液相色谱-同位素稀释串联质谱法(HPLC-IDMS/MS)对人源甲胎蛋白、人源瘦素及重组肌钙蛋白Ⅰ进行准确的定量检测，建立了三者的标准定值参考方法。以下为研究的内容: (1)建立了人源甲胎蛋白的高效液相色谱-同位素稀释串联质谱检测方法。在最优化水解条件及酶解条件下，对人源甲胎蛋白样品进行了预处理。通过分别检测甲胎蛋白水解产物和酶解产物得出人源甲胎蛋白的含量分别为6.371μmol/g和5.464μmol/g，RSD分别为1.2％和2.1％，扩展不确定度分别为0.505μmol/g(k=2)和0.495μmol/g(k=2)，两种方法的线性相关系数均大于0.998。通过T检验表明水解法和酶解法检测人源甲胎蛋白含量的结果达到了良好的一致性，相对偏差为7.6％，从而验证了该方法检测人源甲胎蛋白含量结果的准确、可信。 (2)建立了人源瘦素的高效液相色谱-同位素稀释串联质谱检测方法。在最优化水解条件下，对人源瘦素进行了样品预处理，分别选取人源瘦素水解后的脯氨酸，缬氨酸和亮氨酸同时定量检测，根据检测结果计算得出人源瘦素纯品的含量为0.582g/g，测定结果的扩展不确定度为0.014g/g(k=2)，RSD为5.2％。该方法检测人源瘦素的检出限和定量限分别为0.8×10-4g/g和2.7×10-4g/g，该方法与纯度扣除法检测人源瘦素的结果达到了良好的一致性，相对偏差为4.9％，验证了此方法准确、可信。 (3)建立了重组肌钙蛋白Ⅰ的高效液相色谱-同位素稀释串联质谱检测方法。在最优化水解条件下，对重组肌钙蛋白Ⅰ进行了样品预处理，分别选取重组肌钙蛋白Ⅰ水解后的苯丙氨酸，脯氨酸，缬氨酸和亮氨酸同时定量检测，根据检测结果计算得出重组肌钙蛋白Ⅰ的含量为0.22g/g，扩展不确定度为0.012g/g(k=2)，RSD为4.4％。该方法检测人源瘦素的检出限和定量限分别为1.6×10-4g/g和5.2×10-4g/g。 本文成功建立了高效液相色谱-同位素稀释-串联质谱法测定人源甲胎蛋白、人源瘦素和肌钙蛋白Ⅰ的方法。对样品的水解条件及酶解条件进行了考察和优化，检测结果表明，该方法检测以上三种蛋白含量的结果准确、可信，与其他相关的方法相比，前处理过程简单，结果重复性良好且可溯源至SI单位制，有望成为相应蛋白的参考定量方法，为相关蛋白标准物质的研究奠定了基础。

目录

声明

摘要

缩写对照

第一章 绪论

1．1 甲胎蛋白、瘦素和肌钙蛋白Ⅰ简介

1．1．1 生物标志物

1．1．2 甲胎蛋白及其生理意义

1．1．3 瘦素及其生理意义

1．1．4 肌钙蛋白及其生理意义

1．2 常用于蛋白质定量检测的免疫分析法

1．2．1 放射免疫分析法

1．2．2 荧光免疫分析法

1．2．3 酶免疫分析法

1．2．4 酶联免疫分析法

1．2．5 化学发光免疫分析法

1．2．6 免疫分析法与传感器联用的检测方法

1．3 同位素稀释质谱法定量检测蛋白质

1．4 蛋白质的计量

1．5 本课题的提出

第二章 高效液相色谱-同位素稀释串联质谱法准确检测人源甲胎蛋白的含量

2．1 引言

2．2 实验部分

2．2．1 实验试剂及仪器

2．2．2 人源甲胎蛋白样品的胰蛋白酶酶解定性检测分析

2．2．3 人源甲胎蛋白相对分子质量的检测

2．2．4 人源甲胎蛋白的高效液相色谱分析

2．2．5 蛋白水解氨基酸分析同位素稀释质谱法检测人源甲胎蛋白

2．2．6 蛋白裂解肽段分析同位素稀释质谱法检测人源甲胎蛋白样品

2．3 结果与讨论

2．3．1 UPLC-Q-TOF-MS检测人源甲胎蛋白酶解样品的结果

2．3．2 MALDI-TOF-MS检测人源甲胎蛋白酶解样品的结果

2．3．3 人源甲胎蛋白的相对分子质量检测结果

2．3．4 人源甲胎蛋白的高效液相色谱分析

2．3．5 蛋白水解氨基酸分析同位素稀释质谱法检测人源甲胎蛋白含量的实验结果

2．3．6 蛋白裂解肽段分析同位素稀释质谱法检测人源甲胎蛋白含量

2．4 小结

第三章 高效液相色谱-同位素稀释串联质谱法准确检测人源瘦素的含量

3．1 引言

3．2 实验部分

3．2．1 实验试剂及仪器

3．2．2 人源瘦素的胰蛋白酶酶解定性检测分析

3．2．3 人源瘦素分子量的检测

3．2．4 人源瘦素的高效液相色谱分析

3．2．5 蛋白水解氨基酸分析同位素稀释质谱法检测人源瘦素样品

3．3 结果与讨论

3．3．1 MALDI-TOF-MS／MS定性检测人源瘦素样品的结果

3．3．2 人源瘦素的相对分子质量检测结果

3．3．3 人源瘦素的高效液相色谱分析

3．3．4 蛋白水解氨基酸分析同位素稀释质谱法检测人源瘦素含量的实验结果

3．4 小结

第四章 高效液相色谱-同位素稀释串联质谱法准确检测重组肌钙蛋白Ⅰ的含量

4．1 引言

4．2 实验部分

4．2．1 实验试剂及仪器

4．2．2 重组肌钙蛋白Ⅰ分子量的检测

4．2．3 重组肌钙蛋白Ⅰ的高效液相色谱分析

4．2．4 重组肌钙蛋白Ⅰ的胰蛋白酶酶解定性检测分析

4．2．5 蛋白水解氨基酸分析同位素稀释质谱法检测重组肌钙蛋白Ⅰ

4．3 结果与讨论

4．3．1 重组肌钙蛋白Ⅰ的相对分子质量检测结果

4．3．2 重组肌钙蛋白Ⅰ的高效液相色谱分析

4．3．3 UPLC-Q-TOF检测重组肌钙蛋白Ⅰ酶解产物的结果

4．3．4 MALDI-TOF-MS定性检测重组肌钙蛋白Ⅰ样品的结果

4．3．5 蛋白水解氨基酸分析同位素稀释质谱法检测重组肌钙蛋白Ⅰ含量的实验结果

4．4 小结

第五章 结论

参考文献

致谢

科研成果及所获奖励

作者和导师介绍