激活型免疫受体复合物DAP12-NKG2C自组装分子机制研究

摘要

自然杀伤细胞是淋巴细胞中的第三大组成部分，其功能涉及多种特定的抗感染以及抗肿瘤的自然免疫过程。自然杀伤细胞的激活状态是通过自然杀伤细胞及其靶细胞之间的免疫突触的激活信号以及抑制信号的不断整合从而通过精确的调控达到平衡。激活型免疫受体复合物DAP12-NKG2C是自然杀伤细胞中一种进行激活信号转导的多亚基跨膜蛋白复合物。该复合物中的跨膜蛋白DAP12由一个较短的胞外区、一个单跨膜的跨膜区以及含有免疫酪氨酸激活基元(ITAM)的胞内区这三部分组成，DAP12能形成含二硫键的同源二聚体。该二聚体与受体NKG2C能够通过跨膜区的极性残基的相互作用从而发生聚集，并形成异源三聚体。研究者们最近已经在胶束环境中取得了复合物DAP12-NKG2C跨膜区的晶体结构，为我们提供了该复合物的分子结构信息。然而，该晶体结构表明跨膜蛋白复合物DAP12-NKG2C中关键的极性残基接触与其他实验结果不能很好的吻合，令人疑惑的是该复合物中DAP12二聚体上的两个天冬氨酸残基只有一个与受体NKG2C上的赖氨酸残基有直接接触。到目前为止，激活型免疫受体复合物DAP12-NKG2C的装配原则仍然没有得到完整的揭示，其信号转导机制中的大量结构信息细节也仍然处于缺失的状态。
　　脂筏结构位于细胞质膜上，脂筏结构内富含饱和脂肪酸、胆固醇以及鞘磷脂等。在多种生理过程中，脂筏结构通过募集数目众多的跨膜蛋白来完成多种细胞膜内外的信号转导与物质运输。此外，脂筏结构也被认为是磷脂酰肌醇4，5-双磷酸(PIP2)与蛋白之间发生相互作用与信号调控的平台。近年来大量的实验研究集中在脂筏结构中的T细胞信号转导及自组装机制，然而得到的结果却是矛盾的，而目前脂筏结构在自然杀伤细胞信号转导机制中的作用尚不清楚，且尚无DAP12-NKG2C复合物自组装与脂筏结构关系的相关研究报道。
　　本论文中，我们采取生物化学、分子生物学等实验方法与分子动力学模拟研究相结合的研究策略，对激活型免疫受体复合物DAP12-NKG2C的自组装及其信号转导机制进行研究，主要取得了以下研究进展:
　　1.我们采用TOXCAT系统作为主要的体内实验方法，结合其他体外实验手段，确定了DAP12跨膜区的二聚自组装及其二聚作用界面。CAT活性实验结果表明，在DAP12跨膜区中的极性残基天冬氨酸以及苏氨酸能够显著影响其同源二聚信号，而其跨膜区序列中出现的常见二聚基元GXXXG则并不影响DAP12的二聚活性。由此我们确认极性残基间的相互作用是DAP12跨膜区发生二聚自组装的驱动力，D50XXXT54序列构成其二聚界面。
　　2.根据TOXCAT实验结果，我们先后采用粗粒化模拟方法以及全原子模拟方法对DAP12跨膜区的野生型及其突变体进行了二聚自组装的分子动力学研究。通过对比野生型以及突变体的构象变化，同样发现了二聚界面上的重要极性残基D50与T54。DAP12跨膜区同源二聚体主要采取左手装配方式，二面交叉角约为20°。我们的实验结果以及分子动力学模拟结果取得了非常好的一致性，并与胶束中得到的DAP12跨膜区二聚体NMR结构非常相似。
　　3.随后，我们同样采用粗粒化模拟方法以及全原子模拟方法对激活型免疫受体复合物DAP12-NKG2C的跨膜区自组装进行了分子动力学研究。通过计算机模拟结果及其他实验结果，我们对该复合物跨膜区的NMR结构进行了修正，提出了五个极性残基构成（包括DAP12二聚体中的一对天冬氨酸以及一对苏氨酸，以及受体NKG2C中的一个赖氨酸）的相互作用界面。这个五极性残基结构在该异源三聚体的自组装过程中形成了稳定的静电网络，对维持其紧密装配具有十分重要的作用。此外，我们进一步排除了DAP12-NKG2C异源三聚体与另一条受体NKG2C链结合形成异源四聚体的可能性，并且提出了修正后的复合物DAP12-NKG2C跨膜区自组装的装配原则。
　　4.最后，我们采用粗粒化模拟方法首次揭示了自然杀伤细胞中的免疫受体复合物DAP12-NKG2C以及脂分子PIP2在能够形成脂筏结构的混合膜中的定位情况。我们的分子动力学模拟结果首次发现DAP12-NKG2C复合物的跨膜区位于非脂筏区，而其胞内区则通过碱性残基富集区以及ITAM区中的酪氨酸残基和PIP2的相互作用进入了脂筏区与非脂筏区的交界区。同时通过研究，我们推测PIP2分布于脂筏区中，并且在DAP12-NKG2C复合物的胞内区周围发生聚集，Ca2+离子能够调控PIP2与DAP12-NKG2C复合物胞内区的相互作用从而调节该复合物的信号转导。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 跨膜蛋白简介

1．1．1 α-螺旋跨膜蛋白相互作用机制

1．1．2 跨膜蛋白间相互作用的检测手段

1．2 激活型免疫受体复合物DAP12-NKG2C简介

1．2．1 自然杀伤细胞受体

1．2．2 DAP12简介

1．2．3 NKG2家族简介

1．3 脂筏简介

1．3．1 脂筏的结构

1．3．2 脂筏的信号转导功能及其与疾病的关系

1．3．3 自然杀伤细胞中的脂筏结构

1．3．4 PIP2在脂筏结构中的信号调控

1．4 跨膜蛋白的分子动力学模拟

1．4．1 分子动力学模拟

1．4．2 跨膜蛋白在双分子层中的分子动力学模拟

1．5 本论文研究目的与意义

1．6 本论文主要研究内容

第二章 DAP12跨膜区二聚自组装研究

2．1 引言

2．2 实验部分

2．2．1 实验药品与材料

2．2．2 实验仪器

2．2．3 DAP12跨膜区嵌合体序列

2．2．4 DAP12嵌合体引物序列

2．2．5 缓冲液及培养基配制

2．2．6 实验方法

2．3 实验结果及讨论

2．3．1 DAP12跨膜区及其突变体的TOXCAT嵌合体构建

2．3．2 不同长度DAP12跨膜区嵌合体的二聚活性测定

2．3．3 DAP12跨膜区野生型嵌合体的TOXCAT特定位点突变研究

2．3．4 MalE互补实验结果

2．3．5 Western Blot实验结果

2．3．6 DAP12跨膜区野生型多肽的RP-HPLC分析结果

2．3．7 DAP12跨膜区野生型多肽的质谱鉴定结果

2．3．8 DAP12跨膜区野生型多肽的RP-HPLC制备结果

2．3．9 DAP12跨膜区野生型多肽的CD分析结果

2．3．10 DAP12跨膜区野生型多肽的SDS-PAGE结果

2．4 本章小结

第三章 DAP12跨膜区二聚自组装分子动力学模拟研究

3．1 引言

3．2 模拟体系构建以及参数设定

3．2．1 GROMACS模拟软件

3．2．2 Martini粗粒化力场

3．2．3 DAP12跨膜区自组装序列

3．2．4 DAP12跨膜区自组装模拟参数设置

3．3 实验结果与讨论

3．3．1 DAP12跨膜区野生型在DPPC膜中二聚自组装粗粒化模拟研究

3．3．2 DAP12-WT跨膜区二聚体全原子模拟研究

3．3．3 DAP12跨膜区突变体二聚相互作用粗粒化模拟研究

3．4 本章小结

第四章 DAP12-NKG2C跨膜区自组装机制分子动力学模拟

4．1 引言

4．2 模拟体系的搭建及参数设定

4．2．1 DAP12-NKG2C跨膜区自组装序列选择

4．2．2 DAP12-NKG2C跨膜区自组装模拟体系

4．2．3 DAP12-NKG2C跨膜区自组装模拟参数设置

4．3 实验结果与讨论

4．3．1 DAP12-NKG2C跨膜区野生型自组装的粗粒化模拟

4．3．2 DAP12-NKG2C跨膜区自组装的全原子模拟研究

4．3．3 DAP12-NKG2C跨膜区突变体三聚相互作用粗粒化模拟研究

4．3．4 DAP12-NKG2C跨膜区形成四聚体的可能性探讨

4．4 本章小结

第五章 DAP12-NKG2C在混合膜中自组装分子动力学模拟

5．1 引言

5．2 脂筏模拟体系构建及参数设置

5．2．1 DAP12-NKG2C在混合膜中自组装序列选择

5．2．2 DAP12-NKG2C在混合膜中自组装模拟体系

5．2．3 DAP12-NKG2C在混合膜中自组装模拟参数设置

5．3 实验结果与讨论

5．3．1 脂筏结构的形成及分析

5．3．2 DAP12-NKG2C在脂筏环境中的定位

5．3．3 PIP2对DAP12-NKG2C信号转导的调控作用

5．4 本章小结

第六章 总结与展望

参考文献

致谢

研究成果及发表的学术论文

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