基于DNA和石墨烯量子点构建新型荧光传感器及其生物分析应用

摘要

目前，荧光传感器的设计大多是采用商用的有机染料作为荧光基团，通过向体系中先引入猝作灭基团（如GO，碳纳米管，金纳米颗粒等）再后续引入待测目标的两步操，实现“on-off-on”的信号转换调控从而完成检测。这种设计具有一定的优势，可以消除假阳性信号带来的干扰，降低背景荧光信号，同时也能提高传感器的灵敏度，但是其操作相对繁琐且有机染料的荧光稳定性差，从而在一定程度上限制了其应用。石墨烯量子点(GQDs)是一种准零维的新型荧光纳米材料，与传统的半导体量子点和商用荧光染料相比，GQDs表现出低毒性，更好的光学性能和良好的生物相容性。本论文的工作采用GQDs替代传统的荧光染料修饰到DNA链的一端，利用DNA的结构转换策略来调控GQDs荧光信号的开关，并引入外切酶的信号放大策略，从而构建了一系列新型荧光传感器，实现了对目标DNA，重金属离子，有机小分子以及生物毒素的高灵敏度检测。
　　(1)我们选择两种不同颜色荧光GQDs来修饰两种探针DNA，HIV（人类免疫缺陷病毒DNA）和HBV（人类乙型肝炎病毒DNA）探针，利用燃烧蜡烛得到的碳纳米颗粒(CNPs)作为荧光猝灭剂，加入到HIV和HBV探针混合溶液中，由于单链探针DNA与CNPs之间存在π-π堆积作用，两种探针DNA都被吸附到CNPs表面，使得其对应修饰的两种GQDs与CNPs近距离接触，发生荧光共振能量转移(FRET)，荧光信号猝灭;当HIV和HBV两种待检测目标DNA加入后与探针杂交形成双链DNA从CNPs表面脱离，最终两种GQDs的荧光信号恢复。同时结合ExoⅢ的循环信号放大策略，实现了对HIV和HBV两种目标DNA的高灵敏度检测，检测限可以低至6.56pM和9.5pM，比无ExoⅢ的体系灵敏度提高了60倍，并且能够实现人血清样品中目标DNA的检测。
　　(2)利用赭曲霉素A(OTA)适配体(aptamer)结构转换策略来调控GQDs聚集/解聚行为，从而构建新型的无猝灭剂的荧光传感器，实现了对OTA的高灵敏检测。首先，GQDs被修饰到aptamer和cDNA（与aptamer部分互补的探针DNA）的对应端位置，得到GQDs修饰的两种DNA:cDNA-GQDs和aptamer-GQDs，检测过程分为两步:1）当cDNA-GQDs和aptamer-GQDs混合时，由于aptamer和cDNA之间的杂交诱导所修饰的GQDs聚集从而发生荧光猝灭;2）OTA加入触发GQDs聚集体解聚，荧光恢复。如此可实现对OTA的检测，检测限为13pg/mL，并成功用于实际红酒样品中OTA的加标回收检测。
　　(3)利用3WJ型DNA分子机器调控GQDs聚集/解聚行为构建了微囊藻毒素-LR(MC-LR)的新型荧光传感器。检测过程分为两个部分:1）DNA杂交形成3WJ型DNA结构，诱导p1和p2两种探针DNA末端修饰的GQDs聚集荧光猝灭;2）加入MC-LR引起3WJ型DNA结构破坏，GQDs解聚，荧光恢复。MC-LR的检测限可以低至19.2pg/mL，并能够实现自来水和湖水样品中MC-LR的检测。此外，基于GQDs聚集/解聚还可实现检测过程的循环往复进行。
　　(4)利用富-胸腺嘧啶DNA修饰的GQDs作为荧光探针设计了一个新型的双功能化荧光传感器检测汞离子(Hg2+)和三聚氰胺。首先将GQDs修饰到能够特异性识别Hg2+的单链DNA的一端，在汞离子存在条件下，Hg2+会与DNA上的胸腺嘧啶结合形成T-Hg2+-T的碱基错配，此时Hg2+与GQDs之间的距离过近，两者之间发生电子转移，造成GQDs荧光猝灭;由于随后加入的三聚氰胺与Hg2+之间的配位作用力更强，能够竞争结合走Hg2+，从而使得GQDs的荧光恢复。基于此设计的“on-off-on”的荧光传感器可以实现对Hg2+与三聚氰胺的高灵敏检测，检测限分别为2.5nM和4.9nM，并能够实现实际样品中Hg2+与三聚氰胺的加标回收。最后还构建了以Hg2+与三聚氰胺作为信号输入的荧光逻辑门，只有在Hg2+单独存在时，信号输出才为“1”。

目录

声明

摘要

符号说明

第一章 绪论

1．2 石墨烯量子点的合成

1．2．1 自上而下的合成路线

1．2．2 自下而上的合成路线

1．3 量子产率

1．4 基于石墨烯量子点的荧光传感应用

1．4．1 检测无机离子

1．4．2 检测有机小分子

1．4．3 检测生物标记物

1．5 选题意义和课题思路

1．5．1 选题意义

1．5．2 课题思路

第二章 基于Exo Ⅲ辅助信号放大的GQDs荧光传感器同时检测多目标DNA

2．1 引言

2．2 实验药品和仪器

2．2．1 实验药品

2．2．2 实验仪器

2．3 实验步骤

2．3．1 氧化石墨烯的制备

2．3．2 石墨烯量子点制备

2．3．3 石墨烯量子点表面修饰

2．3．4 碳纳米颗粒的制备

2．3．5 两种目标DNA分别检测

2．3．6 两种目标DNA同时检测

2．3．7 人血清样品与磷酸盐缓冲溶液中的错配对比实验

2．4 实验结果及讨论

2．4．1 实验检测原理

2．4．2 实验可行性分析

2．4．3 石墨烯量子点及表面DNA修饰表征

2．4．4 实验条件的优化

2．4．5 荧光传感器的构建

2．4．6 分别检测两种目标DNA

2．4．7 选择性实验

2．4．8 同时检测两种目标DNA

2．5 本章小结

第三章 适配体结构转换调控GQDs聚集／解聚高灵敏检测霉菌毒素

3．1 引言

3．2 实验药品

3．3 实验步骤

3．3．1 石墨烯量子点的合成

3．3．2 石墨烯量子点表面DNA修饰

3．3．3 赭曲霉素A检测

3．3．4 动力学表征

3．3．5 实际红酒样品中赭曲霉素A的加标回收

3．4 实验结果与讨论

3．4．1 石墨烯量子点及表面修饰DNA表征

3．4．2 实验可行性及电镜表征

3．4．3 实验动力学

3．4．4 荧光猝灭机理

3．4．5 赭曲霉素A检测

3．4．6 实验选择性

3．4．7 实际红酒样品中赭曲霉素A的加标回收

3．5 本章小结

第四章 3WJ型DNA分子机器调控GQDs聚集／解聚高灵敏检测微囊藻毒素-LR

4．1 引言

4．2 实验药品

4．3 实验步骤

4．4．3 实验可行性及电镜表征

4．4．4 实验动力学

4．4．5 微囊藻毒素-LR检测

4．4．6 实验选择性

4．4．7 循环检测性能

4．4．8 实际样品中微囊藻毒素-LR的加标回收

4．5 本章小结

第五章 基于DNA修饰的GQDs构建双功能荧光“on-off-on”传感器检测Hg2+和三聚氰胺及其逻辑门应用

5．1 引言

5．2 实验药品

5．3 实验步骤

5．3．3 实际样品中的加标回收

5．3 实验结果与讨论

5．3．1 实验检测原理

5．3．2 石墨烯量子点及表面修饰DNA表征

5．3．4 实验条件优化

5．3．5 汞离子检测

5．3．6 汞离子选择性

5．3．7 三聚氰胺检测

5．3．9 实际样品中的Hg2+和三聚氰胺的检测

5．3．10 逻辑门应用

5．4 本章小结

第六章 结论与展望

6．1 结论

6．2 展望

参考文献

致谢

研究成果及发表的学术论文

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