全外显子组测序鉴定甲状腺癌全新抗癌lncRNA GAS8-AS1及其抗癌机制研究

摘要

癌症的形成原因十分复杂，与环境因素和遗传因素都紧密相关，因此对癌症体细胞突变及机制研究十分必要。本研究分为两部分:第一部分是用全外显子测序技术分析乳头状甲状腺癌的体细胞突变谱，研究发现了中国人群中高频突变基因长链非编码RNA（lncRNA）GAS8-AS1;第二部分是探究GAS8-AS1的抑癌分子机制，以及对肝细胞癌发生发展的影响。
　　甲状腺癌是最近几年发病率增长最快、最常见的内分泌系统恶性肿瘤。但是，中国人群的甲状腺癌体细胞突变谱图尚不清楚。全外显子组测序信息能够提供癌症基因组的全景式突变信息。因此，本研究在402例中国乳头状甲状腺患者的肿瘤及正常组织标本中鉴定体细胞突变情况，其中实验组91例患者组织进行全外显子组测序;验证组的311例患者组织用Sanger测序进行验证。绘制了中国人群的甲状腺癌体细胞突变谱，以及突变基因图谱，并且发现了三个中国人特异性基因突变特征，与在白人的甲状腺癌突变特征有显著不同。研究发现了23个含有≥3个体细胞突变位点的相关基因，其中BRAF V600E基因突变位点是甲状腺癌的突变热点，在59％的患者中都发现了BRAF突变，并且在存在肿瘤细胞淋巴结转移患者中突变率显著增高(P=1.6×10-6)，因此BRAF基因是影响甲状腺癌发生的关键驱动基因。除此之外，研究鉴定到的突变率排名第二的突变基因是lncRNA GAS8-AS1。GAS8-AS1基因上包含两个突变位点分别是c.713A＞G/714T＞C，他们通常以双突变的形式存在，该突变热点与疾病的进展情况显著相关(P=0.009)。细胞实验表明，野生型的lncRNA GAS8-AS1(基因型为A713T714)和突变型的lncRNA GAS8-AS1（基因型为G713C714）皆能抑制肿瘤细胞生长，但突变型的lncRNA GAS8-AS1比野生型基因的抑癌能力有所减弱。本研究中还发现了另一个重要显著突变基因溶血磷脂酸酶受体LPAR4，它是一类G蛋白偶联受体蛋白，有七次跨膜结构域，该基因在甲状腺癌患者中突变位点为c.872T＞G(p.Ile291Ser)。LPAR4作为一个癌基因，在PI3K-AKT信号通中发挥了重要作用。因此，在中国人甲状腺癌中编码RNA和非编码RNA都起到重要作用，BRAF信号通路和PI3K信号通路是主要突变富集的信号通路。
　　lncRNA在癌症中作用越来越受到重视。中国的肝细胞癌患者古全世界的比例高达50％，lncRNA在肝癌中起到非常重要的作用。根据第一部分研究，lncRNA GAS8-AS1是位于16号染色体GAS8基因的2号内含子区的转录产物为994nt的长链非编码RNA。但是其作用机制尚不清楚。在第二部分的研究中，我们证明了它在染色质重塑和基因的表达调控中发挥重要作用。在肝细胞癌组织的表达情况检测中，GAS8-AS1以及其宿主基因GAS8表达量在癌组织中相对较低，并且与不良预后相关。在细胞实验中，发现GAS8-AS1和GAS8基因能够抑制细胞增殖，在不影响细胞周期的情况下促进细胞凋亡，促进抗癌靶向药物索拉菲尼的敏感性，并且能够抑制细胞的侵袭转移，以上都说明GAS8-AS1和GAS8都是抑癌基因。值得关注的是，GAS8-AS1和GAS8表达水平存在正相关关系说明可能存在表达调控关联性。即使在GAS8启动子附近有丰富的CpG岛，但是并未发现GAS8-AS1对DNA甲基化的影响。但是，我们成功的找到与GAS8-AS1相互作用的蛋白为与组蛋白修饰相关的酶混合谱系白血病基因(MLL1)和及其分子伴侣WD-40重复蛋白5(WDR5)。通过染色质免疫共沉淀和RNA免疫共沉淀技术证实了lncRNA GAS8-AS1能够募集组蛋白修饰复合体MLL1/WDR5至GAS8基因启动子区，以维持染色质结构的开放性，促进RNA聚合酶Ⅱ(PolⅡ)的结合激活GAS8基因的表达。
　　本研究首次通过全外显子组测序绘制了中国人群甲状腺癌基因突变图谱，找到多个与癌症相关的基因突变位点及信号通路。本文创新点在于发现了一个长链非编码RNA GAS8-AS1在乳头状甲状腺癌和肝细胞癌中都起到重要的抑癌作用，其机制是通过表观遗传学修饰调(H3K4me3)控邻近宿主基因GAS8的表达，进而影响癌症的发生发展。证明了长链非编码RNA在癌症中的重要作用，丰富了长链非编码RNA在表观遗传学基因表达调控的机制，为临床诊断和治疗提供重要的理论基础。

目录

声明

摘要

符号和缩略词说明

1．1．引言

1．2．癌症的特点

1．2．1．乳头状甲状腺癌

1．2．2．肝细胞癌

1．3．测序技术的发展

1．3．1．第一代测序技术

1．3．2．第二代测序技术

1．3．3．第三代测序技术

1．4．非编码RNA

1．4．1．短链非编码RNA

1．4．2．长链非编码RNA

1．5．表观遗传修饰

1．6．lncRNA的递送与应用前景

1．6．1．利用非病毒类基因递送系统递送lncRNA

1．6．2．lncRNA的应用前景

1．7．展望

2．1．研究设计与研究对象

2．2．主要实验仪器

2．3．主要实验耗材

2．4．主要实验试剂

2．5．遗传物质的提取

2．5．1．组织研磨

2．5．2．组织全基因组DNA提取

2．5．3．外周血全基因组DNA提取

2．5．4．RNA的提取

2．5．5．菌体扩增和质粒的提取

2．6．全外显子垒-flN序与Sanger测序验证

2．6．1．全外显子组测序

2．6．2．Sanger测序

2．7．分子生物学实验

2．7．1．聚合酶链式反应(PCR)

2．7．2．琼脂糖凝胶电泳

2．7．3．转录组RNA逆转录成cDNA

2．7．4．荧光定量PCR测定基因表达

2．8．细胞基础培养

2．8．1．细胞复苏

2．8．2．细胞传代

2．8．3．细胞冻存

2．9．瞬时转染基因的敲低或过表达

2．9．1．siRNA的转染

2．9．2．过表达载体质粒转染

2．10．细胞功能实验

2．10．1．台盼蓝细胞生长计数实验

2．10．2．平板克隆集落形成实验

2．10．3．细胞周期测定

2．10．4．细胞凋亡测定

2．10．5．细胞划痕实验

2．10．6．Transwell侵袭实验

2．10．7．核质分离实验

2．11．蛋白质免疫印迹

2．12．Sequenom质谱法测DNA甲基化

2．13．染色质免疫共沉淀

2．13．1．交联与水解

2．13．2．超声

2．13．3．蛋白质／DNA免疫沉淀

2．13．4．洗脱蛋白质／DNA复合体

2．13．5．解交联

2．13．6．DNA纯化

2．13．7．实时荧光定量PCR

2．14．RNA-蛋白质免疫共沉淀

2．15．裸鼠体内成瘤实验

2．15．1．小鼠荷瘤实验

2．15．2．石蜡组织包埋

2．15．3．HE染色实验

2．15．4．免疫组化实验

第三章 实验结果

3．1．全外显子测序鉴定乳头状甲状腺癌的驱动基因

3．1．1．乳头状甲状腺癌突变特征

3．1．2．与甲状腺癌相关的体细胞突变基因

3．1．3．长链非编码RNA GAS8-AS1甲状腺癌驱动突变基因

3．1．1．跨膜蛋白LPAR4的突变会影响中国人群甲状腺癌发生

3．1．2．细胞通路变化分析

3．1．3．小结

3．2．长链非编码RNA GAS8-AS1的调控机制研究

3．2．1．肝细胞癌组织中GAS8-AS1与GAS8表达的相关性

3．2．2．GAS8-AS1和GAS8能够抑制肝癌细胞的增殖

3．2．3．通过索拉菲尼用药GAS8-AS1和GAS8能够促进肝癌细胞的凋亡

3．2．4．GAS8-AS1和GAS8能够抑制肝细胞癌的侵袭转移

3．2．5．lncRNA GAS8-AS1通过表观遗传学修饰调控GAS8表达

3．2．6．lncRNA GAS8和GAS8基因的小鼠荷瘤实验

3．2．7．小结

第四章 总结与讨论

附录

参考文献

致谢

研究成果及已发表的学术论文

作者及导师简介