过氧亚硝酸根对胰岛素中酪氨酸硝基化反应活性顺序的研究

摘要

在生物体内，过亚硝酸根（ONOO-）是由一氧化氮和超氧根阴离子反应生成的一种细胞毒性物质，具有强氧化和硝化能力，可以和许多生物大分子反应，其中蛋白质的氧化和硝化修饰是目前研究较多的一个课题。许多疾病都与ONOO-的过量产生及3-硝基酪氨酸（3-NT）的生成有关，如慢性炎症、动脉粥样硬化、癌症等。其中ONOO-对胰岛素的硝化已被作为胰岛β细胞死亡及Ⅱ型糖尿病产生的影响因素之一。
　　 池泉通过向胰岛素溶液中一次加入过量ONOO-的方法，对ONOO-诱导胰岛素硝化产物的生物学活性进行了分析，得出单硝化胰岛素产物与受体结合能力明显降低，但是最先被硝化的TyrA14位点并未处于胰岛素与受体的结合部位，且其质谱信号较弱，同时其用于凝胶电泳分析的单硝化产物未分离完全。王云海通过恒定流速持续注入ONOO-结合HPLC-MS/MS的方法鉴定了胰岛素的硝化位点，并首次通过傅立叶变换红外光谱研究了硝化后胰岛素二级结构的变化，但其通过Tyr位点所在酶切肽段的色谱峰面积来判断硝化顺序欠严谨。
　　 本实验首先针对之前实验中存在的反应过程中pH未加控制，ONOO-在通入反应溶液前有分解等问题做了改善，优化出了一套ONOO-对蛋白质的硝化模拟体系。通过停流动力学装置测出实验条件下ONOO-的半衰期为0.58s，结合文献中对生理环境下ONOO-的恒定动态浓度计算得出了通入蛋白质缓冲液中的速率。在注入反应液ONOO-的同时，以相同的速率注入0.1M HCl来中和ONOO-注入过程中引入的0.1M NaOH。同时冰袋控温来减少ONOO-反应前的分解。
　　 其次通过恒定流速持续注入ONOO-与优化的蛋白质硝化模拟体系两种实验方法对ONOO-诱导胰岛素Tyr位点硝化的活性顺序进行了鉴定。前一种方法能使胰岛素中四个Tyr位点完全硝化，对Tyr位点硝化的活性顺序能进行更加系统的研究；后一种方法更接近于体内生理环境。通过HPLC-ESI-MS/MS对两种方法产生的硝化产物分析得出ONOO-对胰岛素硝化生成三种单硝化产物、四种二硝化产物。通过硝化胰岛素二硫键还原产物的质谱离子流图验证了三种单硝化产物的生成。并首次通过检测硝化肽段色谱峰的出现顺序来确定胰岛素中四个酪氨酸位点硝化的优先性。结果显示，TyrA19、TyrB16、TyrA14都是比较容易被硝化的位点，TyrA19、TyrB16位点最先被硝化，从而出现三种单硝化产物，TyrB26位点最难硝化，且只有在TyrB16硝化后才能被硝化。
　　 最后，对三种单硝化产物进行了分子动力学模拟，来阐明3-硝基酪氨酸的生成对胰岛素二级结构的影响，并对胰岛素中酪氨酸硝化的优先性进行了合理解释。TyrB26只有在TyrB16硝化后才能被硝化，与TyrB16硝化后胰岛素二级结构发生变化，TyrB26位点外翻有关。
　　 本实验通过两种实验方法鉴定了ONOO-诱导胰岛素Tyr位点硝化的活性顺序，并结合分子动力学模拟给出了合理的解释，对研究ONOO-对蛋白质Tyr位点硝化的选择性及其与硝化引起的蛋白质二级结构变化的关系方面有重要意义。

目录

文摘

英文文摘

第1章 绪论

1.1 过氧亚硝酸根的概述

1.1.1 过氧亚硝酸根的性质

1.1.2 过氧亚硝酸根的危害

1.2 胰岛素的概述

1.2.1 胰岛素的结构特征

1.2.2 胰岛素的生理功能

1.2.3 胰岛素与疾病

1.3 蛋白质硝化损伤的检测方法

1.4 蛋白质硝基化与糖尿病关系的研究进展

1.5 本课题研究内容

第2章 过氧亚硝酸对胰岛素硝化模拟体系的建立

2.1 引言

2.2 实验方案

2.2.1 主要试剂和仪器

2.2.2 过亚硝酸根溶液的制备

2.2.3 过亚硝酸根半衰期的测定

2.2.4 过氧亚硝酸根一次加样方法

2.2.5 过氧亚硝酸根连续注入方法

2.2.6 胰岛素硝化反应装置的优化

2.3 结果与讨论

2.3.1 过氧亚硝酸根半衰期的测定

2.3.2 胰岛素硝化实验

2.4 本章小结

第3章 胰岛素硝基化修饰产物的鉴定

3.1 引言

3.2 材料和方法

3.2.1 主要试剂和仪器

3.2.2 胰岛素硝化实验

3.2.3 胰岛素硝化产物的HPLC-ESI-ITMS分析

3.2.4 肖化胰岛素的还原

3.2.5 硝化胰岛素还原后的烷化

3.2.6 胰岛素和硝化胰岛素的酶解

3.2.7 胰岛素和硝化胰岛素的酶解肽谱的分析

3.3 结果与讨论

3.3.1 过氧亚硝酸根对胰岛素硝化损伤的HPLC-ESI-ITMS分析

3.3.2 肖化胰岛素还原后的HPLC-ESI-ITMS分析

3.3.3 胰岛素和硝化胰岛素酶解后的HPLC-ESI-ITMS分析

3.4 本章小结

第4章 胰岛素硝化后的结构变化及硝化机理探讨

4.1 胰岛素的结构对其硝化的影响

4.2 单硝化产物的分子动力学模拟

4.2.1 方法

4.2.2 结果与讨论

4.3 本章小结

结论

参考文献

攻读硕士学位期间所发表的学术论文

致 谢