红细胞膜包覆双氢青蒿素聚乳酸-羟基乙酸仿生纳米粒的制备及抗疟作用评价

摘要

目的：　　为了延长双氢青蒿素（dihydroartemisinin，DHA）在体内的作用时间，提高其抗疟疗效，并且基于疟原虫感染的宿主红细胞能与正常红细胞通过“玫瑰花环”效应产生亲和粘附作用，本文构建了抗疟药物双氢青蒿素聚乳酸-羟基乙酸纳米粒（poly（lactic-co-glycolic）acid）-dihydroartemisininnanoconjugates，PDNs），进一步用红细胞膜包覆制备得到仿生纳米粒（redbloodcellmembranecloaked-PDNs，RPDNs），以期通过“玫瑰花环”效应，增加红细胞膜仿生纳米粒向感染红细胞的靶向药物递送，对仿生纳米粒的制备方法进行优化，通过考察仿生纳米粒的制剂学特性、体外抗吞噬、体外靶向性，体内抗疟药效、仿生纳米制剂的安全性以及血液长循环特征，为红细胞膜仿生纳米粒应用于抗疟药物给药系统构建，改善双氢青蒿素药物的不足，实现靶向药物递送，提高抗疟药物疗效提供基础与思路。　　方法：　　1.双氢青蒿素聚乳酸-羟基乙酸纳米粒的制备及质量表征　　采用纳米沉淀法制备双氢青蒿素聚乳酸-羟基乙酸纳米粒（PDNs），通过单因素优化法和响应面优化法筛选得到PDNs纳米粒较优处方；通过高速离心法以及高效液相-柱后衍生化法测定并计算PDNs纳米粒的包封率（entrapmentefficiency,EE）与载药量（drug-loading，DL）；采用傅里叶红外光谱（IR）、差示扫描量热分析（DSC）等对PDNs进行质量表征；采用MaterialsStudio软件中DPD模块对PDNs形成过程进行分子动力学模拟。　　2.双氢青蒿素红细胞膜仿生纳米粒的制备及制剂学性质考察　　采用低渗法提取红细胞膜，通过超声法与共挤出法制备得到不同粒径的红细胞囊泡（redbloodcellvesicles，RVs）；通过将RVs与PDNs共挤出制备得到红细胞膜仿生纳米粒（RPDNs）；通过透射电镜（transmissionelectronmicroscope，TEM）观察PDNs与RPDNs的形态；对PDNs与RPDNs的粒径、PDI及Zeta电位进行表征；采用激光共聚焦对荧光标记的红细胞膜仿生纳米粒进行共定位分析；采用透析法考察PDNs与RPDNs的释放行为；考察两种纳米粒的血清稳定性与初步稳定性；采用SDS-PAGE蛋白电泳与WesternBlot实验检测RPDNs表面相关蛋白；考察两种纳米粒的体外溶血性。　　3.双氢青蒿素红细胞膜仿生纳米粒的体外抗吞噬及体外靶向性考察　　以香豆素-6（coumarin6，C6）为荧光探针，通过纳米沉淀法制备载C6的荧光纳米粒（PC6Ns）以及共挤出法制备载C6的红细胞膜仿生纳米粒（RPC6Ns）；对荧光纳米粒粒径、PDI、Zeta电位、包封率和载药量进行表征；采用透析法考察荧光纳米粒的释放行为；通过体外培养小鼠单核巨噬细胞RAW264.7对RPC6Ns的体外抗吞噬特性进行考察，高内涵细胞成像分析系统与激光共聚焦观察巨噬细胞对RPC6Ns的吞噬情况，流式细胞仪对吞噬情况进行定量考察；将RPC6Ns与PyBY265感染的疟原虫红细胞共孵育，激光共聚焦下观察荧光分布和强度，计算皮尔逊共定位系数，考察红细胞膜仿生纳米粒对疟原虫感染红细胞的亲和靶向作用。　　4.双氢青蒿素红细胞膜仿生纳米粒的体内抗疟药效、安全性及长循环评价　　构建约氏鼠疟模型，静脉注射五种剂量的PDNs和RPDNs纳米粒混悬液，采用皮尔逊四天抑制法进行给药。四天连续给药后，停药第1天，小鼠尾尖采血、涂片、染色、镜检，计算小鼠体内疟原虫的感染率、抑制率、50%有效剂量（ED50）、90%有效剂量（ED90）；停药第1周，再次采血、涂片、染色、镜检，计算小鼠体内疟原虫的感染率；观察14天，取血检测血常规指标、肝功能指标，采集心、肝、脾、肺、肾进行组织切片与病理分析，每天记录小鼠体重与生存只数；正常小鼠体内注射PDNs和RPDNs纳米粒，观察14天，取血检测血常规指标，考察纳米粒的安全性；以荧光染料DiD为探针，制备载DiD红细胞膜仿生纳米粒，正常小鼠尾静脉注射DiD标记的红细胞膜仿生纳米粒，于不同时间点取血，酶标仪测定荧光强度，考察红细胞膜仿生纳米粒的体内长循环特性。　　结果：　　1.双氢青蒿素聚乳酸-羟基乙酸纳米粒制备及处方优化结果　　通过单因素优化法以及响应面法优化，得到较优处方，通过较优处方制备得到PDNs纳米粒其粒径分布均匀（71.23±0.78nm，PDI：0.05±0.01），并且有绝对值较高的Zeta电位（–21.63±1.59mV），EE为70.10±0.79%，DL为1.21±0.09%，纳米粒混悬液外观呈淡蓝色乳光。在红外光谱图中，PDNs冻干粉末在1750cm-1与3370cm-1处有最大吸收，分别为PLGA与DHA的特征峰，没有新的峰形出现，差示扫描量热分析结果中未见DHA结晶的特征熔融吸热峰；通过DPD粗粒化模拟，从微观角度了解到PDNs纳米粒形成的动态过程，双氢青蒿素药物通过氢键相互作用以及范德华力被包裹在PLGA聚合物材料的疏水性的内核中。　　2.双氢青蒿素红细胞膜仿生纳米粒的制备及制剂学性质考察　　采用低渗处理法得到红细胞膜，用超声法与共挤出法制备红细胞囊泡RVs，依次通过不同孔径大小的聚碳酸酯（PC）膜得到囊泡尺寸为85.62±2.39nm、Zeta电位约为-29mV的RVs。将RVs与PDNs共挤出制备得到红细胞膜仿生纳米粒RPDNs，测得粒径：86.40±2.54nm、PDI：0.179±0.011，其Zeta电位与制备得到的RVs的电位值较接近（-29.20±4.19mV），并且观察其外观呈粉红色乳状；透射电镜图能看到RPDNs呈明显的“核壳”结构，在荧光共定位图中观察到两种荧光重合，表明红细胞膜成功包覆在PDNs纳米粒表面。在30%无水乙醇-PBS释放介质中，RPDNs中DHA在24h的累积释放量为39.23%，PDNs为48.28%。两种纳米粒在胎牛血清以及4℃的水中稳定性良好。SDS-PAGE蛋白电泳表明红细胞膜仿生纳米粒中的大部分膜蛋白被保留，WesternBlot结果显示抗吞噬蛋白CD47被保留。体外溶血试验结果表明仿生纳米粒中没有红细胞聚集及溶血现象发生。　　3.双氢青蒿素红细胞膜仿生纳米粒的体外抗吞噬及体外靶向性考察　　高内涵细胞成像分析系统与激光共聚焦观察单核巨噬细胞RAW264.7对两种纳米粒的摄取结果显示，RPC6Ns相对于PC6Ns有效地降低了单核巨噬细胞对纳米粒的摄取。通过细胞成像分析系统中内吞模块定量分析结果显示，RPC6Ns平均颗粒数目远低于PC6Ns平均颗粒数目；流式细胞仪定量结果表明红细胞膜仿生纳米粒成功逃避巨噬细胞的吞噬。考察RPC6Ns对疟原虫感染红细胞的体外靶向性，激光共聚焦观察结果显示，RPC6Ns基本不进入正常红细胞，但可以进入疟原虫感染的红细胞，对感染红细胞具有亲和作用，计算皮尔逊共定位系数为0.7173，表明红细胞膜仿生纳米粒对疟原虫感染的红细胞存在靶向亲和作用，使纳米粒能够富集在感染红细胞周围。　　4.双氢青蒿素红细胞膜仿生纳米粒的体内抗疟药效、安全性及长循环评价　　停药第1天，测得PDNs与RPDNs组的ED50值分别为0.53±0.01μmol/kg，0.13±0.05μmol/kg与课题组前期所得到的DHA溶液组的ED50值（0.87±0.27μmol/kg）相比存在显著性差异（P0.05）。停药第1周，所有组中疟原虫的感染率都有所上升，在8.8μmol/kg药物浓度下，RPDNs组的感染率均低于PDNs组，并且通过14天观察，RPDNs治疗的小鼠组生存良好，红细胞膜仿生纳米粒明显提高药物的抗疟活性。在PDNs和RPDNs给药组中，随着DHA的剂量的增加，疟原虫的感染率逐渐降低，存在剂量依赖性。通过对治疗小鼠与正常小鼠的血常规进行分析，PDNs与RPDNs组中血常规的各项指标都在正常阈值范围内。通过对小鼠组织器官进行Hamp;E病理分析，PDNs组与RPDNs组未发现病理损伤。对纳米粒进行体内长循环特性考察，红细胞膜仿生纳米粒RPDiDNs在正常小鼠体内半衰期为32.716±0.611h明显高于PDiDNs纳米粒（23.911±1.464h）（P0.05），充分证明红细胞膜仿生纳米粒可以实现在体内的长循环作用。　　结论：　　1.双氢青蒿素红细胞膜仿生纳米粒的制备及质量表征　　红细胞膜仿生纳米粒（RPDNs）呈明显的核壳结构，粒径均匀、有良好的EE和DL，红细胞膜蛋白被保留在纳米粒表面，在血清中与4℃水中比较稳定，具有缓释释药的特性，体外溶血性实验均符合预期要求。　　2.双氢青蒿素红细胞膜仿生纳米粒体外免疫逃逸及体外靶向性考察　　红细胞膜仿生纳米粒可以逃逸巨噬细胞的吞噬，避免药物被免疫系统清除，延长药物的作用时间；体外靶向性研究表明红细胞膜仿生纳米粒对感染疟原虫的红细胞有一定的亲和靶向作用，可以实现靶向递送药物。　　3.双氢青蒿素红细胞膜仿生纳米粒的体内抗疟药效，安全性及长循环评价　　综合比较不同评价指标，RPDNs的抗疟活性强于PDNs以及DHA溶液组，仿生纳米粒表现出较好的抗疟活性以及安全性，并且能够在小鼠体内实现血液中长循环。

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